LC-MS法測定不同產地蛇足石杉石杉堿甲含量

李關艷，蘇有勇

(昆明理工大學 現代農業工程學院，云南 昆明 650504)

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LC-MS法測定不同產地蛇足石杉石杉堿甲含量

李關艷，蘇有勇*

(昆明理工大學 現代農業工程學院，云南 昆明 650504)

建立起一套基于液相色譜串聯質譜聯用法(LC-MS)測定石杉堿甲(Hup A)含量的方法。樣品用1.5%CH3COOH提取總生物堿，在正離子模式下，采用離子監測模式(SIM)檢測，定量分析離子為50～2 000m/z，在Agilent ZORBAX SB-C18平臺上(4.6 mm×250 mm)，流動相(體積比)為甲醇∶水(90∶10)，流速0.5 μL·min-1，檢測波長310 nm，柱溫28 ℃，進樣量10 μL。結果表明，在前述試驗條件下，Hup A在50～400 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好(r=0.999 4)。利用該方法測定4產地蛇足石杉不同部位Hup A含量，結果顯示，蛇足石杉葉和莖中的含量均是云南(玻璃溫室種植)>江西>湖南>福建。

蛇足石杉； 石杉堿甲； LC-MS； 含量測定

蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb. ex Murray) Trev]，又名蛇足石松、千層塔、金不換，具有止血散瘀、消腫止痛、清熱除濕、解毒等功效，民間主要用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、內傷出血、毒蟲叮咬、燒傷燙傷等癥[1-2]。自1972年中國首次報道該植物中所含的生物堿——石杉堿甲(Hup A)在動物試驗中有松弛橫紋肌的作用后，研究人員后續又發現Hup A是一種高效、低毒、可逆、高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑，可用于改善記憶力，治療重癥肌無力和老年性癡呆等疾病，并對抑制有機磷酸中毒有一定功效，其制劑哈伯因已在國內上市，主要用于治療老年人記憶減退和早年癡呆等[3-5]。

國內外研究學者對Hup A衍生物、類似物的合成及全合成做了眾多研究，但其合成步驟煩瑣、成本較高，且存在環境污染及難以獲得純光學活性合成物等問題，至今仍無法進行工業化生產[6-8]。也有學者基于內生真菌與其共生宿主可以交換遺傳物質這一理論，從野生蛇足石杉中分離純化內生真菌獲得產石杉堿甲菌株，雖然從已分離獲得的內生真菌代謝產物中能夠提取出與宿主植物相同的活性成分Hup A，但野生菌發酵次生代謝產物中所含石杉堿甲量甚微，離工業化生產石杉堿甲還有很大距離[9-13]。因此，Hup A的市場供給主要還是以自然資源為主，少量人工栽培。蛇足石杉在自然界中生長極其緩慢，其孢子約需15 a才能自然萌發[14]，而且由于其生長環境因子不同，不同生長地點的蛇足石杉中Hup A含量亦不同，導致不同產地原材料質量參差不齊。本研究擬建立起一套基于HPLC-MS直接測定蛇足石杉中Hup A含量的方法，并利用該方法對比了不同生長地蛇足石杉不同部位中Hup A的含量，以期為蛇足石杉植物資源的采摘、栽培以及蛇足石杉質量控制和評估提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

Agilent 1100 LC/MS Series Trap SL系統，美國Agilent公司；色譜柱，ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HHS數顯恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；超聲波清洗機，昆山超聲儀器有限公司；微型植物試樣粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司；旋蒸儀，EYELA倍捷科技；循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 材料

蛇足石杉對照品購買于國家標準品對照品供應站，Hup A對照品經HPLC峰面積歸一化法檢測質量分數大于97.0%。本試驗所用的云南蛇足石杉成株，于2014年9月至2016年6月種植在昆明理工大學現代農業工程試驗性玻璃溫室，湖南蛇足石杉于2016年6月采購于湖南省保靖縣白云山，福建蛇足石杉于2016年6月采購于福建省南平市政和鎮，江西蛇足石杉于2016年6月采購于江西省宜春市宜豐縣。甲醇為進口色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水，氨水、氯仿、冰醋酸均為分析純。

1.3 測定波長的確定

石杉堿甲結構優化采用B3LYP/6-311++G(d,p)方法與基組，將此結構作為激發態輸入文件，在TDDFT/B3LYP/6-311++G(d,p)方法與基組下計算50個激發態分子軌道躍遷能量，所得計算值采用函數擬合。計算結果表明，該分子在297 nm左右有較大的紫外吸收。根據此數據，設定280、290、300、310 nm波長進行測定分析。結果顯示，在波長310 nm下，能有效減少樣品中其他成分的干擾，其靈敏度和響應值最大，因此，后期檢測波長采用310 nm。

1.4 色譜條件

Agilent 色譜柱；流動相為甲醇：水，體積比90:10，流速0.5 μL·min-1；檢測波長310 nm；柱溫28 ℃；進樣量10 μL。

1.5 質譜條件

ESI離子源，離子阱質量分析器；干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量9 L·min-1；噴霧壓力35 psig(英制單位，儀器設定需要，1 psi=6.894 76 kPa)；毛細管電壓3 500 V。在正離子模式下，采用選擇離子監測模式(SIM)檢測，其定量分析離子為m/z50～2 000。

1.6 對照品溶液的制備

精密稱重Hup A對照品8 mg，用甲醇定容至20 mL，配制成濃度為400 μg·mL-1的石杉堿甲對照儲備液，再分別稀釋成50、100、160、200 μg·mL-1的對照品溶液，封口置于4 ℃冰箱，臨用放置至室溫。

1.7 供試品溶液的制備

為不同產地的新鮮蛇足石杉植株編號，用流動水洗凈根部泥土，洗凈的植物樣品置于50 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎并精確稱重后置于100 mL三角燒瓶中，加入1.5% CH3COOH，料液比1∶10，冷浸12 h，超聲45 min(水溫45 ℃，功率80%)，冷卻后過濾。濃氨水堿化至pH值9，氯仿萃取3次，每次200 mL，合并氯仿提取液回收至干，甲醇溶解后定容至5 mL，取1 mL溶液過0.45 μm有機濾頭，置于液相瓶中以備分析。

1.8 數據處理及分析

應用SPSS 17.0的ANOVA過程進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan法(P=0.05)。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

按1.4、1.5節設定的條件進行測定，采用外標法進行定量，對照品及樣品的檢測譜圖分別見圖1、圖2。可見在試驗設定條件下，各成分分離效果良好，峰形對稱，無拖尾現象。對照品及樣品中Hup A的保留時間分別為9.487、9.793 min，m/z=243為Hup A的[M+H]+峰，整個分離過程只需11 min。

圖1 Hup A對照品(左)和樣品(右)色譜圖

圖2 Hup A對照品(左)和樣品(右)MS譜圖

2.2 測定方法的線性關系

按1.4、1.5節設定的條件分析5組濃度的對照品溶液(50、100、160、200、400 μg·mL-1)，以峰面積為縱坐標y，Hup A濃度(μg·mL-1)為橫坐標x進行回歸，得標準曲線y=27.192x+16.283(R2=0.999 4)，在50～400 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.3 測定方法的精準度

取400 μg·mL-1的Hup A對照品溶液，按1.4、1.5節設定的條件，重復進樣5次，測得Hup A峰面積的變異系數(RSD)為0.71%，表明儀器的精密度良好。

取玻璃溫室種植蛇足石杉全株，按1.7節設定的條件提取，按1.4、1.5節設定的條件進行測定，重復5次，Hup A峰面積的RSD為1.75%，表明該方法重復性良好。

取4產地的蛇足石杉樣品，按1.7節方法制備成溶液后，分別放置1、3、5、8、12 h，依照1.4、1.5節設定的條件進行測定。在12 h內，4個產地樣品溶液中Hup A峰面積的RSD(n=3)分別為：玻璃溫室0.63%，湖南0.77%，福建0.87%，江西0.62%，表明供試樣品中的Hup A在12 h內穩定。

取400 μg·mL-1的Hup A對照品溶液0.3 mL加入0.7 mL的樣品提取液中，按1.4、1.5節設定的條件測定，計算Hup A的含量，計算加樣回收率。結果詳見表1?？梢钥闯觯瑯悠返幕厥章收w較高，在94.74%～98.06%，且變異系數在1.67%～1.91%。

2.4 不同產地樣品Hup A含量對比

按1.4、1.5節設定的條件，采用外標法進行定量，4個產地蛇足石杉中Hup A在莖、葉中的含量見圖3?？梢钥闯?，不同栽培環境對蛇足石杉藥用成分Hup A含量具有顯著影響。蛇足石杉葉片中Hup A的含量以種植于溫室大棚的樣品最高，且顯著(P<0.05)高于其他樣品，福建樣品葉片中Hup A的含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他樣品。蛇足石杉莖中Hup A的含量以種植于溫室大棚與江西樣品最高，且顯著(P<0.05)高于其他樣品，福建樣品莖中Hup A的含量最低，且顯著(P<0.05)低于其他樣品?？傮w來看，Hup A在蛇足石杉葉和莖中的含量均是云南(玻璃溫室種植)>江西>湖南>福建。

表1 回收率試驗的結果

柱上標有不同大、小寫字母的分別表示各產地蛇足石杉莖與葉片中含量差異顯著(P<0.05)圖3 不同產地蛇足石杉樣品中的Hup A含量

3 小結與討論

不同的化合物各自都對應有最大紫外吸收波長，只有在最大紫外吸收波長下，才能獲得最大的響應值[15]。Hup A結構優化采用B3LYP/6-311+++G(d,p)方法與基組，理論測算顯示，該分子在297 nm有較大的紫外吸收，實測結果310 nm，與理論值十分接近且誤差在15 nm之內，表明該理論測算方法具有較強的指導意義。

先前的研究多采用HPLC法對蛇足石杉植株的Hup A等生物堿進行分離檢測，本試驗首次使用LC-MS法對蛇足石杉植株的Hup A進行檢測，結合離子荷質比可以更準確地確定Hup A的分離情況。相比袁經權等[16]、杜次等[17]的試驗結果，本試驗條件下各成分分離效果良好，峰形對稱，無拖尾現象，整個分離過程只需11 min，洗脫時間更少，且避免了使用毒性較高的乙腈洗脫試劑和酸性溶液，有助于保護試驗人員和分析儀器。

蛇足石杉生長范圍廣，環境因子對其Hup A含量影響較大[18]，相比袁經權等[16]報道的Hup A含量(廣西龍勝縣蛇足石杉，莖中含量0.018 0%、葉中0.035 9%)，本試驗中溫室大棚種植的蛇足石杉莖(0.044 4%)葉(0.055 9%)部位中Hup A的含量更高，與杜次等[17]描述的湘西鳳凰兩頭羊產地蛇足石杉莖葉中Hup A含量(0.043 8%、0.055 2%)相差不多。在生物堿的提取過程中，浸泡溫度、浸泡時間、酸化程度、溶劑選擇、提取手段、pH值以及萃取次數等都會對生物堿的提取率造成一定的影響。本試驗在傳統提取手段中加入超聲波協助溶劑提取，通過控制溫度、超聲時間等措施，有助于提高生物堿的提取率。

總體來看，本試驗所采用的基于LC-MS測定蛇足石杉中Hup A含量的方法快速，簡便，準確，重復性好，可為蛇足石杉植物資源的采摘、規?；耘嘁约百|量控制和評估等提供新的參考依據。

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(責任編輯：高 峻)

2017-02-09

李關艷(1991—)，女，云南昭通人，碩士，研究方向為藥用植物種苗繁育， E-mail：1319048359@qq.com。

蘇有勇(1969—)，男，云南昆明人，教授，博士，研究方向為生物質能，E-mail：497611561@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170729

Q946.88

A

0528-9017(2017)07-1186-04

注：衷心感謝中科院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續利用國家重點實驗室周俊課題組提供試驗儀器。

文獻著錄格式：李關艷，蘇有勇. LC-MS法測定不同產地蛇足石杉石杉堿甲含量[J].浙江農業科學，2017，58(7)：1186-1189.