CE法分離檢測對羥基苯丙酮酸互變異構體

蔣秀燕，王叢叢

(中國石油大學勝利學院化學工程學院，山東東營 257061)

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CE法分離檢測對羥基苯丙酮酸互變異構體

蔣秀燕，王叢叢

(中國石油大學勝利學院化學工程學院，山東東營 257061)

采用毛細管電泳-安培檢測法測定了對羥基苯丙酮酸烯醇-酮式互變異構現象。采用以直徑為0.3mm的碳微電極為工作電極的三電極系統，分離電壓18kV，毛細管長度60cm，電泳液是添加了3mmol/L的β-環糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，兩異構體在15min內實現基線分離。

烯醇式-酮式互變異構體，對羥基苯丙酮酸，毛細管電泳，安培檢測

人體內酪氨酸代謝過程中會產生對羥基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid，pHPP)。對羥基苯丙酮酸的測定可以幫助診斷一些代謝紊亂所引起的疾病[1-2]。目前對于水溶液中其烯醇式-酮式互變異構現象的研究有高效液相色譜法[1]、電化學法[2]、毛細管電泳-紫外檢測法[3-4]等，本文利用毛細管電泳-安培檢測法(CE-AD)研究對羥基苯丙酮酸在水溶液中的互變異構現象，建立了分離測定其互變異構現象的新方法。

1 實驗部分

1.1 設備與試劑

實驗室自組裝毛細管電泳-安培檢測設備；未涂層石英毛細管(25μm i.d×60cm)，河北永年光纖廠；安培檢測器(BAS LC-4C型)，美國西拉斐特；無極可調高壓電源(0～30kV)，上海原子核研究所；三電極工作系統(工作電極為自制直徑為0.3mm的碳微電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉑

電極)；HW-2000色譜工作站，南京千譜軟件有限公司。

β-環糊精(色譜純)、pHPP(色譜純)，美國Sigma化學品公司；水為Milipore高純水；其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

實驗用pHPP分別用水與甲醇溶解配制成5.0×10-3mol/L的儲備液，冷藏于冰箱。實驗時以緩沖液稀釋。實驗所用試液均需用聚乙烯濾膜(0.22 μm)過濾，超聲波除去試液中細小氣泡。實驗前，毛細管需經堿洗、水洗清潔，經緩沖液活化15min。實驗應用電動進樣方式，進樣時間10s，電壓18kV，隨后電泳分離與檢測。實驗在大約20℃的室溫下進行。

2 結果與討論

2.1 pHPP烯醇式與酮式互變異構平衡

文獻[4]報道，pHPP以甲醇配置溶液冷藏放置數十天不會發生異構轉化，但pHPP在水溶液中發生由烯醇式(圖1-A)向酮式(圖1-B)轉化的異構現象，平衡時多以酮式異構體存在。

圖1 pHPP的互變異構體

2.2 檢測電位

毛細管電泳-安培檢測中，工作電極上電位的選擇對檢測的靈敏度、檢測限和穩定性有重要的影響。在添加了3mmol/L的β-環糊精溶液的pH=6.60、50mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，考察了pHPP烯醇式與酮式異構體的動態伏安性質。取異構充分的pHPP水溶液進行實驗。烯醇式與酮式異構體的峰電流隨檢測電位的升高均顯著增大；pHPP兩異構體的峰電流在檢測電位低于0.80V時明顯減小；在高于1.00V的檢測電位下，信噪比降低，基流升高；選擇1.00V為工作電極的檢測電位。

2.3 緩沖液

比較幾種常見緩沖液(硼砂-磷酸二氫鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸鹽緩沖液，pH=6.60)對分離的影響。發現在磷酸鹽緩沖體系中兩種異構體的分離效果較好，峰形較對稱。

考察濃度范圍40mmol/L～80mmol/L的磷酸鹽緩沖液對pHPP兩種異構體分離行為的影響。兩種異構體在緩沖液濃度低于50mmol/L時不能實現分離；在緩沖液濃度達到70mmol/L時，峰展寬，靈敏度降低，遷移時間延長。實驗選定磷酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L。

考察pH值的影響，兩種互變異構體在pH值大于6.10時實現分離；在pH=6.50時峰形變對稱；繼續升高pH值，峰展寬，遷移時間變長。實驗選定pH=6.60為最佳pH值。

2.4 添加劑

β-環糊精與待測組分形成包合物有助于待測物的分離，也是選擇β-環糊精作為添加劑的原因。β-環糊精分子結構是一個內空去頂、上寬下窄的錐形體，由7個D-(+)-吡喃葡萄糖組成。錐形體外部分布著分子中所有羥基，其中在寬口端順時針方向指向排列著7個羥基，糖苷氧原子和氫原子位于其空腔內。該結構特點使β-環糊精具有親水性外殼與疏水性內腔，易與一些有機物質形成主-客體包合物。pHPP分子中苯環靠其疏水作用由β-環糊精分子的錐形體寬口端進入，在腔內二者形成包合物，靠氫鍵作用結合兩分子，其中β-環糊精與烯醇式結構的異構體間氫鍵作用更強，使包合物更穩定，并減少了其所帶負電荷，使其出峰早于酮式異構體。

圖2 β-環糊精與pHPP形成包合物的圖示

考察了β-環糊精濃度在1mmol/L～5mmol/L范圍內對分離效果的影響。加入β-環糊精增加了分離度，縮短了待測物遷移時間，改善了峰展寬；但當β-環糊精的濃度增加到4mmol/L時，兩種互變異構體由于出峰時間的提前不能完全分開。Wren和Rowe[5]認為，添加劑存在一個最優濃度，大小受形成包合物的兩物質的結合常數的影響；二者結合常數越小，所需添加劑濃度越高，反之則越低。同時加入β-環糊精使峰電流降低，由于β-環糊精是電中性的化合物，與待測物質包合后，使pHPP所帶凈負電荷減少，遷移速度加快。結合分離效果與出峰時間，選定3mmol/L為實驗最佳添加劑濃度。

2.5 進樣時間

進樣時間過短則峰電流小，影響檢測靈敏度；進樣時間過長則會因樣品的擴散引起峰展寬，使分離效率與分離度下降；綜合考慮，設定進樣時間10s。

2.6 分離電壓

電泳速度、毛細管中的電場強度均由分離電壓的大小來決定，分離度與分析時間進而受其影響。分離電壓低于15kV時，分離物在毛細管內嚴重擴散，導致譜峰展寬、靈敏度下降；分離電壓越大，出峰時間越短；但焦耳熱增加，基流增高。綜合考慮，選擇18kV為實驗電壓。在以上所有最佳實驗條件下，待測物的毛細管電泳譜圖如圖3所示。實驗條件：5.0×10-5mol/L的 pHPP水溶液；pH=6.60，濃度為50mmol/L的PBS緩沖液；25μm i.d×60cm的毛細管；0.3mm碳圓盤微工作電極；1.00V的檢測電位；10s的進樣時間；18kV的分離電壓。

A pHPP的烯醇式結構 B pHPP的酮式結構

圖3 pHPP標準水溶液的電泳圖

Fig.3 The electropherogram of standard solution of pHPP

2.7 方法重現性、線性范圍與檢測下限

在實驗條件下，通過對5.0×10-6mol/L的pHPP標準溶液重復進樣分析，對方法的重現性進行考察。峰高和遷移時間的相對標準偏差(RSD，n=3)分別為2.92%和3.26% 。

配制pHPP甲醇溶液，使pHPP完全以烯醇式結構存在，分別稀釋為1.0×10-5mol/L～1.0×10-8mol/L濃度范圍的待測溶液，對方法的線性范圍進行考察，檢測下限依據三倍信噪比原則確定，結果見表1。

表1 線性范圍和檢測下限

3 結論

應用毛細管電泳-安培檢測法在β-環糊精做添加劑的條件下研究了對羥基苯丙酮酸的烯醇式與酮式異構體的拆分。結果表明，緩沖體系對異構體的分離與分析有很大的影響，選擇合適的緩沖溶液及控制合適的pH值使分離有很大的提高，同時添加劑的選擇使分離產生了很好的效果。

[1] 黃穎，張曉麗，陳國南.高效液相色譜法研究對羥基苯丙酮酸烯醇-酮式互變異構動力學[J].福建師范大學學報：自然科學版，2009，25(3)：77-79.

[2] 黃穎，張曉麗，占春榮，等.多壁碳納米管修飾玻碳電極用于對羥基苯丙酮酸的電化學研究[J].福建師范大學學報：自然科學版，2010，26(3)：47-51.

[3] 郭晴，常理文，陳義.尿中微量芳香酸的高效毛細管電泳分析——用于苯丙酮尿癥的診斷[J].分析化學，2001(9)：1000-1002.

[4] HUANG Lu，HUANG Ying，CHI Yu-wu，et al. Study on the kinetics of keto-enol tautomerism of P-hydroxyphenylpyruvic Acid using capillary electrophoresis [J]. J Chromatogr A，2007，10(78)：44-49.

[5] Wren S A C，Lukacs K D. Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis：I. Initial evaluation of a model[J]. J Chromatogr A，1992，603：235-241.

Determination of the Tautomerization of p-Hydroxyphenylpyruvic Acid by CE

JIANG Xiu-yan，WANG Cong-cong

(School of Chemical Engineering Shengli College China University of Petroleum，Dongying 257061，Shandong，China)

The enol-keto tautomerism of p-hydroxyphenylpyruvic acid was investigated by capillary electrophoresis with amperometric detection. A three electrode system with a carbon microelectrode (i.d. 0.3mm) as the working electrode was used. The two tautomers were separated and detected within 15min at 18kV of applied voltage and a 60cm (i.d. 25μm) length capillary in 50mmol/L phosphate buffer (pH=6.60) including 3mmol/Lβ-cyclodextrin.

the enol-keto tautomerism，hydroxyphenylphruvic acid，capillary electrophoresis，amperometric detection

O 657.8