RNA干擾沉默claudin-4基因表達對子宮內膜癌細胞生物學行為的影響

馮翠平，張慶霞，趙 芳，李 忻，張 韞，潘曉玉?

（1.中日友好醫院 婦產科，北京 100029；2.中日友好醫院 臨床醫學研究所，北京 100029）

實驗研究

RNA干擾沉默claudin-4基因表達對子宮內膜癌細胞生物學行為的影響

馮翠平1，張慶霞1，趙 芳1，李 忻2，張 韞2，潘曉玉1?

（1.中日友好醫院 婦產科，北京 100029；2.中日友好醫院 臨床醫學研究所，北京 100029）

目的：采用RNA干擾技術沉默claudin-4基因在子宮內膜癌細胞Ishikawa中的表達，探討claudin-4表達下調對Ishikawa細胞增殖力和侵襲力的影響；比較RNA干擾前后差異表達的蛋白質，探討claudin-4基因在子宮內膜癌發病機制中的作用。方法：設計靶向claudin-4的小干擾RNA （siRNA），轉染人子宮內膜癌細胞Ishikawa。采用CCK分析法檢測干擾前后細胞增殖能力的變化，Transwell小室實驗檢測干擾前后細胞侵襲能力的變化。應用雙向凝膠電泳和質譜分析檢測RNA干擾前后蛋白質表達的差異。結果：claudin-4基因沉默可以顯著降低子宮內膜癌細胞的增殖能力和侵襲能力 （P＜0.05）。應用蛋白質組學技術比較claudin-4 siRNA干擾前后蛋白質表達的差異，共鑒定出5種差異蛋白質。結論：claudin-4基因具有促進子宮內膜癌細胞增殖和細胞侵襲的作用，這種作用可能通過改變差異蛋白的表達得以實現。

子宮內膜癌；claudin-4；小干擾RNA；蛋白質組學

Author’s address Department of Obstetrics and Gynecology，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，隨著精準醫學和個體化靶向治療的發展，從基因水平研究子宮內膜癌的確切發病機制成為時下的熱點[1，2]。

緊密連接是正常上皮細胞穩態的關鍵結構，這種結構是腫瘤增長和侵潤的屏障，緊密連接完整性的丟失直接影響癌細胞的營養攝取、細胞增殖和細胞侵潤。claudin是構成緊密連接結構、維持緊密連接功能所必須的一類骨架蛋白，近年來研究發現，claudin-4在多種癌組織中表達異常。我們的前期研究發現：claudin-4在子宮內膜癌中的表達顯著高于在正常子宮內膜中的表達，為了探討claudin-4基因表達對子宮內膜癌細胞生物學行為的影響，我們采用RNA干擾和蛋白質組學技術進一步研究claudin-4在子宮內膜癌發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa由北大人民醫院魏麗惠教授惠贈，Ishikawa細胞呈claudin-4陽性表達。細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，實驗前24h更換無酚紅培養基以避免潛在的性激素模擬效應。

1.2 實驗方法

1.2.1 小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）的合成及細胞轉染

根據人Claudin-4基因序列，選擇Claudin-4-homo-1762位點設計siRNA，序列信息5'UUACAGUGAUGAAUAGCUCTT 3'。轉染方法按Lipofectamine 2000產品說明書進行。轉染細胞經Real-time PCR、Western blot檢測，確定細胞轉染效率＞75%。實驗設立Mock組（M，只加入相同劑量轉染試劑組）；陰性對照組（N，加入相同劑量的轉染試劑及無關序列siRNA組）作為參照。

1.2.2 CCK-8實驗檢測轉染前后Ishikawa細胞的增殖能力

轉染前后Ishikawa細胞按3×105/孔接種于96孔板。分別于培養后24h、48h、72h和96h為檢測點。每次檢測前，在培養液中每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃溫箱孵育 2h，酶標儀檢測450nm處吸光度值。吸光度代表細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.2.3 體外侵襲實驗檢測轉染前后Ishikawa細胞的侵襲能力

將50mg/L Matrigel用無血清的RPMI 1640培養基按1：5比例稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，轉染48h后的各組細胞以3×104/孔接種至Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。培養72h后細胞結晶紫染色，顯微鏡下觀察移至膜下層的細胞并計數。每個樣本計數5個視野，取平均值，以穿膜細胞數的多少表示細胞侵襲能力。實驗重復3次。

圖1 claudin-4 siRNA干擾前后細胞的生長曲線

圖2 claudin-4 siRNA干擾前后細胞侵襲力的變化

圖3 claudin-4 siRNA干擾前后蛋白質表達差異圖

1.2.4 雙向凝膠電泳和質譜分析

收集約1×107的Ishikawa細胞，溶于400μl含1%蛋白酶抑制劑的樣品裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT）中。將1mg蛋白與水化上樣液 （終濃度：7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS、50 mmol/L DTT、0.5%pH 3～10 IPG緩沖液以及痕量溴酚藍）混勻，上樣總體積為450μl。選用固相pH梯度干膠條（IPG，24cm，pH 3～10 NL）在等電聚焦儀上等電聚焦。第二向凝膠電泳通過Ettan DALT six垂直平板電泳系統進行。經考馬斯亮藍染色的凝膠經Image-Scanner Model PowerLook 2100XL掃描儀成像后，利用Image-Master 2D Platinum分析軟件對獲取的圖像進行蛋白點檢測、配對和統計分析。差異2倍和P＜0.05的蛋白點認為差異顯著。將差異顯著的蛋白點經切膠、提取，進行MALDI-TOF/TOF MS分析，經MASCOT檢索，確定差異蛋白質點。

1.3 統計學方法

應用SPSS13.0統計軟件進行分析。率的比較采用χ2檢驗，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 Ishikawa細胞claudin-4 siRNA干擾前后細胞增殖力的檢測

Mock組、陰性對照組、claudin-4 siRNA干擾組細胞生長曲線見圖1。各時間點Mock組與陰性對照組細胞增殖力無明顯差異（P＞0.05）。與其它2組比較，claudin-4 siRNA干擾組在 24h、48h、72h和96h細胞增殖力均顯著下降（P＜0.05）。

2.2 Ishikawa細胞claudin-4 siRNA干擾前后細胞侵襲力的檢測

Mock組、陰性對照組、claudin-4 siRNA干擾組細胞培養48h時穿膜細胞數分別為 （215±18）、（200±16）和（60±7）個。Mock組與陰性對照組的穿膜細胞數無明顯差異（P＞0.05）；與其它2組比較，claudin-4 siRNA干擾組的穿膜細胞數明顯減少，細胞侵襲力顯著下降（P＜0.05）（圖2）。

2.3 差異蛋白質組學分析

與未干擾組相比，claudin-4 siRNA干擾組出現5種蛋白表達差異（圖3）。其中，泛素特異性蛋白酶 7 （ubiquitin specific processing protease 7，USP7） 和 酰 基 蛋 白 硫 酯 酶 1 （acyl protein thioesterase 1，APT1）表達升高，而LASP-1（LIM and SH3 domain protein 1，LASP-1）、內質網蛋白29 （endoplasmic reticulum protein 29，ERP29）和過氧化還原酶5（peroxiredoxin5，PRDX5）蛋白表達降低。

3 討論

3.1 claudin-4與子宮內膜癌發病的關系

近年來研究發現，claudin-4在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌及多種腫瘤細胞系中均呈升高的表達[3]，提示claudin-4的異常表達可能與惡性腫瘤的發生、發展密切相關。我們前期研究發現，claudin-4在子宮內膜樣腺癌中的表達顯著高于在正常子宮內膜中的表達[4]，由此推測，claudin-4的異常升高表達可能與子宮內膜癌的發病相關。為了進一步探討claudin-4與子宮內膜癌的關系，我們對高表達 claudin-4的子宮內膜癌細胞系Ishikawa進行了研究，發現孕激素處理Ishikawa細胞后，Ishikawa細胞中claudin-4的表達明顯降低[5]；以Ishikawa細胞制備子宮內膜癌動物模型，發現順鉑化療后移植瘤中claudin-4的表達亦顯著降低[6]。上述研究結果可以推論與正常子宮內膜相比，claudin-4在子宮內膜癌中表達顯著升高，claudin-4的過度表達可能參與了子宮內膜癌的發病機制。

腫瘤的侵襲和轉移嚴重影響著患者的預后，為了進一步探討claudin-4與子宮內膜癌惡性行為的關系，我們對子宮內膜癌細胞系Ishikawa進行了深入的研究。當采用RNA干擾技術沉默claudin-4的表達后，發現Ishikawa細胞的增殖能力和侵襲能力均顯著降低。表明claudin-4基因的表達參與了子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲，并能促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。Hwang等[7]研究發現claudin-4基因可以促進胃癌細胞的侵襲和轉移能力。Agarwal等[8]研究發現claudin-4在原發性卵巢癌中呈顯著高表達，其升高表達的程度與卵巢癌組織分級和臨床分期呈正相關。將claudin-4的野生型基因轉染正常卵巢上皮細胞系，可以導致細胞侵襲力和細胞遷移力增加；用RNA干擾技術沉默claudin-4在卵巢癌細胞系的表達，細胞的侵襲力顯著下降。claudin-4基因在多種腫瘤細胞中均呈現出與本研究類似的作用，說明claudin-4的升高表達可以顯著增加細胞的侵襲力。但是，在Michl等[9]的研究中發現，將SUIT-2胰腺癌細胞過表達claudin-4會導致胰腺癌細胞的侵襲力和細胞增殖力下降。這種生物學行為的差異，可能是由于claudin-4屬于高度細胞學依賴，不同細胞的生長環境決定了其組織功能間的差異表達。

3.2 claudin-4表達異常對子宮內膜癌細胞蛋白質表達的影響

claudin-4基因沉默可以顯著降低子宮內膜癌細胞的增殖能力和侵襲能力，可能的機制為：claudin-4 siRNA通過結合目的DNA，在轉錄水平影響 claudin-4基因表達；claudin-4 siRNA與mRNA競爭影響其翻譯過程，進而影響其下游與細胞增殖和轉移有關的信號傳導通路，抑制了claudin-4基因的表達。為了了解其潛在的作用機理，我們對claudin-4 siRNA前后的蛋白質表達譜進行了研究。發現RNA干擾后USP7和APT1蛋白表達升高，而LASPl、ERP29和PRDX5蛋白表達降低。

USP7是泛素特異性修飾酶家族的成員之一，是P53底物特異性去泛素化蛋白酶，USP7能使P53免于降解，穩定或者修復細胞內P53表達水平，從而起到抑制腫瘤生長的作用[10]。APT1是具有硫酯酶活性和磷脂酶活性的酶。一方面，APT1通過其硫酯酶活性參與蛋白質棕櫚酰化修飾的調節，在細胞信號的傳導中起著非常重要的作用。另一方面，APT1還通過其磷脂酶活性調節溶血磷脂水平，在細胞增殖以及肌動蛋白細胞骨架的重構過程中發揮關鍵調節作用[11]。LASPl蛋白是一種細胞遷移運動中特殊的肌動蛋白結合蛋白，在多種上皮組織呈差異性表達。已有文獻證實LASP-1在肝癌和腎癌等多種惡性腫瘤中高表達，并和腫瘤的侵襲和轉移密切相關[12]。ERP29是位于真核細胞內質網的可溶性蛋白，在內質網應激時表達顯著增強，而內質網應激可以經細胞信號傳導通路誘導細胞凋亡[13]。PRDX5是過氧化物酶家族蛋白的一種，主要定位于線粒體，能保護線粒體DNA免受過氧化氫的損傷，PRDX5通過控制活性氧水平負性調控氧化應激誘發的細胞凋亡[14]。可見，claudin-4 siRNA后對細胞增殖、凋亡、轉移信號水平均產生影響，造成抑制子宮內膜癌細胞生物學行為的蛋白USP7和APT1表達升高，而增強子宮內膜癌細胞生物學行為的蛋白 LASP-1、ERP29和PRDX5表達降低。由于claudin-4的表達受多種信號傳導通路的調節，RNA干擾Ishikawa細胞后具體引起了哪種信號傳導通路的改變尚需進一步研究。

本研究結果表明，claudin-4是子宮內膜癌發生、發展過程中的一個促進因素，參與了子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為。隨著對claudin-4研究的不斷深入，將對探討子宮內膜癌發病機制、治療和判斷預后產生深遠意義。

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Effects of silencing claudin-4 gene expression by RNA interference on biological behavior of endometrial cancer cell

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FENG Cui-ping，ZHANG Qing-xia，ZHAO Fang，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Jun，31（3）：167-170

Objective：To detect the efficacy of downgrading claudin-4 expression on cell proliferation and invasion of Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell line in response to silence claudin-4 gene expression by RNA interference technique.To compare the difference of protein expression and to discuss the effect of claudin-4 gene on the pathogenesis of endometrial cancer.M ethods：Small interfering RNA (siRNA)was designed to target claudin-4 and transfected into human endometrial cancer cells-Ishikawa cells. The proliferation and invasion capability of Ishikawa cells before and after the interference were evaluated by CCK and transwell analysis.The difference of protein expression was also detected before and after the interference by 2D gel and mass spectrometry.Results：Effective knockdown of claudin-4 suppressed the proliferation and reduced the invasion capability of Ishikawa cells.Further proteomics analysis revealed that USP7 and APT1 were up-regulated while LASP1，ERP29 and PRDX5 were down-regulated by silence of claudin-4.Conclusion：Knockdown of claudin-4 suppressed cell proliferation and reduced the invasion capability of Ishikawa cells by down-regulation of key proteins involved in cell proliferation and invasion.

endometrial carcinoma；claudin-4；small interfering RNA；proteomics

R737.3

A

1001-002592017）03-0167-04

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.03.011

國家自然科學基金（編號30901599）

1* 本文通訊作者。

馮翠平（1976-），女，主治醫師，醫學碩士。

2017-03-17

2017-04-19