標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價

方韻

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215100）

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價

方韻

（蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215100）

目的：探討用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定注射用硫酸核糖霉素的抗生素效價。方法：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其效價，與《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定用抗生素微生物檢定法二劑量法測定其效價進(jìn)行比較。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定其濃度在3.2～7.81 U/mL范圍內(nèi)菌圈清晰，標(biāo)準(zhǔn)品所致抑菌直徑平均值的校正值與抗生素濃度對數(shù)線性關(guān)系良好（r2＝0.998 7）。結(jié)論：本法與二劑量法比較，結(jié)果無顯著性差異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法；抗生素效價；注射用硫酸核糖霉素

硫酸核糖霉素為氨基苷類廣譜抗生素，對革蘭陽性、陰性菌均有抑制作用，對葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、大腸桿菌和部分變性桿菌菌株有效，抗菌作用較卡那霉素略弱。本品對綠膿桿菌、結(jié)合桿菌無效[1]。由于氨基苷類抗生素?zé)o特征紫外吸收[2]，不能直接采用傳統(tǒng)HPLC-UV法測定，《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定用抗生素微生物檢定法—管碟法（二劑量法[3]）測定其抗生素微生物活性（效價）[4]，本文采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[5-7]測定其效價，效果較好，結(jié)果滿意。

1 主要儀器與試劑

1.1 儀器

CAM-IIIB智能型抑菌圈測定儀（上海波浦電腦系統(tǒng)工程有限公司），LMQC-80E立式高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司），E240分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），定量培養(yǎng)皿（直徑90 mm），牛津杯，陶瓦蓋等。

1.2 試劑和藥品

抗生素檢定Ⅰ型培養(yǎng)基（pH 7.8～8.0，批號：130301，來源：中檢院），枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]，核糖霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號：130348-9301，含量：695 U/mg，來源：中檢院），注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941，15092942，15092943，來源：江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司蘇州制藥廠）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 緩沖液、菌懸液及雙碟制備

磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）：取磷酸氫二鉀5.59 g與磷酸二氫鉀0.41 g，加水使成1 000 mL，濾過，在115℃滅菌30 min。

菌懸液制備：將枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35～37℃培養(yǎng)7天，用革蘭染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30 min，備用。取適量菌懸液，用滅菌水稀釋至培養(yǎng)基儲備混懸液的比例直到滿意的抑菌區(qū)域（中間濃度S3的抑菌直徑約為14～16 mm）。

雙碟制備：取直徑約90 mm，高16～17 mm的平底雙碟，分別注入20 mL加熱融化的抗生素培養(yǎng)基，使碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺上使其凝固，作為底層；另取含菌液的培養(yǎng)基5 mL倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固。在每一個雙碟中以等距離均勻放置牛津杯6個，用陶瓦圓蓋覆蓋，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

2.2.1 中心濃度的選擇 根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，在抗生素項下規(guī)定的劑量與反應(yīng)線性范圍內(nèi)選擇一個中間濃度S3＝5 U/mL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的確定 依照標(biāo)準(zhǔn)品說明書規(guī)定，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液按等比級數(shù)稀釋。計量間的距離為1∶1.25，算出中間劑量鄰近的高低2個濃度，S3＋1及S3－1，再分別計算各劑量的濃度，各濃度分別為3.20，4.00，5.00，6.25，7.81 U/mL。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)核糖霉素溶液的制備 精密稱取核糖霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用滅菌水制成1 000 U/mL，精密吸取20 mL至200 mL量瓶中，加磷酸緩沖液（pH 7.8）稀釋制成100 U/mL。再分別精密吸取3.20，4.00，5.00，6.25， 7.81 mL至100 mL量瓶中，用pH 7.8磷酸緩沖液稀釋至刻度，制成中間濃度為5 U/mL及Si（i1-i5）各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品測定 取已制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液S1，S2，S3，S4，S5，其中S3為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度5 U/mL，除S3外，將標(biāo)準(zhǔn)品分為1，2，3，4個組，每組3～5個碟子，每個碟子放置6個牛津杯，如圖1所示。在1，2，3，4組的每個碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中分別滴入S1，S2，S4，S5在36～37℃下培養(yǎng)16～18 h，測得每個抑菌圈直徑。

2.2.5 供試品測定 將供試品稀釋成與標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度S3一致的濃度U（5 U/mL），如圖2所示。在1，2，3，4組的每個碟子的1#，3#，5#中滴入S3，在2#，4#，6#中滴入供試品U（5 U/mL）。在36～37℃下培養(yǎng)16～18 h，測得每個抑菌圈直徑。

圖1 各標(biāo)準(zhǔn)品擺放位置

圖2 供試品擺放位置

2.2.6 進(jìn)行初始計算及變異性的適用性檢查 對于每種濃度的3個碟，分別求出對應(yīng)的9個中間濃度標(biāo)準(zhǔn)品的平均值XR及各組求得的總平均值P。分別求出S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直徑的9個Si平均值XS，然后求出每3個碟得到的9個數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)而計算出其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，該值應(yīng)不超過10%）[5]，結(jié)果見表1和表2。

2.2.7 進(jìn)行碟間的差異校正 令

可得出4組雙碟的4個反應(yīng)參數(shù)，列于表2（其中XC＝標(biāo)準(zhǔn)品平均值的校正值；XS＝原始的標(biāo)準(zhǔn)品的平均值；XR＝對照值的平均值；P＝校正值）[5]。

2.2.8 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)品所致的抑菌直徑平均值的校正值XC為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，見表3，得回歸方程：

見圖3。

表1 硫酸核糖霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗數(shù)據(jù)—中間濃度S3所致的抑菌圈直徑平均值XS及P值

表2 硫酸核糖霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗數(shù)據(jù)—S1，S2，S4，S5所致抑菌圈直徑平均值XR及XC值

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

圖3 線性回歸結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 供試品效價的測定

與制備中心濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液同法操作制備供試品溶液，供試品溶液的濃度為5 U/mL，在36～37℃下培養(yǎng)16～18 h，測得各抑菌圈的直徑，分別求得供試品溶液抑菌圈直徑的平均值，通過線性方程，計算出供試品所含效價（U/mL），再通過與對照中心濃度比較，得出供試品百分比含量（%）。

本文按此方法測定三批注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941，15092942，15092943），并與二劑量法進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。

表4 兩種方法測供試品結(jié)果比較

3.2 重現(xiàn)性試驗

取注射用硫酸核糖霉素（批號：15092941），按本法測定3次，測得值為98.2%，97.6%，99.3%，其平均值為98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.88%。

4 討論

管碟法是國內(nèi)外常用的抗生素檢定法[8]，《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規(guī)定的抗生素效價測定法其原理是根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對數(shù)劑量與抑菌圈直經(jīng)（面積）呈線性關(guān)系，比較標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）兩者對接種的特定試驗菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗菌的繁殖而呈現(xiàn)透明的抑菌圈大小，計算出供試品的效價[3]。因為實驗過程中影響結(jié)果的因素較多，任何一個環(huán)節(jié)操作不當(dāng)或疏忽就會造成很大誤差，甚至導(dǎo)致整組實驗的失敗[8-9]。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定效價與二劑量法相比較，可以減少檢驗過程中的變異性，在數(shù)天得到的一系列小的、獨立的綜合含量結(jié)果，與相同數(shù)量的碟或比色管得出的單一的、大的含量結(jié)果比較，其評估的效價更科學(xué)。

本文用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定注射用硫酸核糖霉素抗生素效價，選擇標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度為5 U/mL，加菌液適量可現(xiàn)直徑在14～16 cm的菌圈，其抑菌圈較邊緣為清晰。而且與二劑量法相比較，結(jié)果沒有顯著性差異，實驗過程雖然繁瑣，但結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

[1] 吳麗輝.硫酸核糖霉素?zé)o菌噴霧工藝的改進(jìn)[J].福建化工,2005,4(4):25-26.

[2] 王舒,高永良.氨基糖苷類藥物研究新進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2009,25(4):329-333.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版)四部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:160-165.

[4] 國家藥典委員會.衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)(抗生素藥品第一冊)[S].1989:89.

[5] The United States Pharmacopeial Convention. Biological Tests/＜81＞ Antibiotics-Microbial Assays USP39-NF34[S].2016:143-161.

[6] 喬曉芳,楊景秀.標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定土霉素片的抗生素效價[J].中國醫(yī)藥指南,2014,12(35):72-73.

[7] 高嵐,姜鳳麗,秦朝英,等.標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定硫酸多粘菌素B的抗生素效價[J].化學(xué)分析計量,2009,18(4):80-81.

[8] 蔣惠嵐.管碟法測定抗生素效價的影響因素及控制方法[J].中國獸藥雜志,2011,45(8):53-55.

[9] 胡向東.生物檢定法測定抗生素效價的因素分析[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24(1):105.

本文編輯：魯守琴

Determination of Antibiotic Titer of Ribostamycin Sulfate for Injection by Standard Curve Method

Fang Yun
(Suzhou Institute for Drug Control, Jiangsu Suzhou 215100, China)

Objective：To investigate the determination of antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection by standard curve method. Methods：The antibiotic titer of ribostamycin sulfate for injection was determined by standard curve method, and the result was compared with that by 2-dose assay in antibiotics microbial test in Chinese Pharmacopeia (Volume Ⅳ, 2015 edition). Results：Standard curve method showed that the bacterial inhibition rings of the standard at the concentrations of 3.2～7.81 U/mL were clear, while the calibration value of the average diameter of bacterial inhibition rings caused by the standard substance showed a good linear relationship to the logarithm of antibiotic concentrations (r2＝0.998 7). Conclusion：The determination result by standard curve method showed no signifcant difference with that by 2-dose assay, indicating high accuracy and reproducibility of standard curve method.

Standard Curve Method; Antibiotic potency; Ribostamycin Sulfate for Injection

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.015

2017 - 04 - 12

方韻，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥品質(zhì)量檢測與分析。E-mail：32315503@qq.com