反相高效液相色譜法同時測定丹參中5種成分含量

侯超

（鄭州市中醫(yī)院制劑室，河南 鄭州 450000）

◆醫(yī)藥快訊◆

反相高效液相色譜法同時測定丹參中5種成分含量

侯超

（鄭州市中醫(yī)院制劑室，河南 鄭州 450000）

目的：建立反相高效液相色譜法同時測定丹參中5種成分含量。方法：采用反相高效液相色譜法，色譜柱Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相梯度洗脫，測定丹參中5種成分的含量。結(jié)果：隱丹參酮、丹參酮IIA、丹酚酸、丹參素、迷迭香酸分別在0.420 0～16.800 0 μg，0.414 0～16.560 0 μg，0.656 0～26.240 0 μg，0.059 5～2.380 0 μg，0.346 0～13.840 0 μg范圍內(nèi)線性良好，r＝0.999 9，RSD均＜1.2%（n＝6），加樣平均回收率98.68%～99.15%。結(jié)論：反相高效液相色譜法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，同時可用于測定丹參中脂溶性和水溶性成分，可較全面控制丹參質(zhì)量。

反相高效液相色譜法；丹參；含量測定

丹參屬雙子葉唇形科植物丹參的干燥根及根莖。近年來，廣泛應(yīng)用于臨床心血管疾病治療，具有降血壓、抗血栓、降血脂、增加冠狀動脈血流量、改善血液循環(huán)的作用，中醫(yī)認(rèn)為其有活血通經(jīng)、清心除煩、祛瘀止痛的功效。丹參中主要功能成分為丹參素[1-2]。丹參中主要含有水溶性和脂溶性兩大類成分，脂溶性成分主要由丹參酮類成分如隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA等組成；水溶性成分主要由丹參酚酸類的丹參素、迷迭香酸、紫草酸、原兒茶醛、丹酚酸B等組成[3-4]。由于丹參中脂溶性成分和水溶性成分眾多，丹參的產(chǎn)地多元化，葉子大小、生長年限、根莖粗細(xì)、栽培方式不同，丹參的質(zhì)量參差不齊[5]。單一的指標(biāo)成分不能完全衡量丹參的藥材質(zhì)量，本研究選取丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸3種水溶性成分，隱丹參酮、丹參酮ⅡA 2種脂溶性成分，梯度洗脫，建立5種成分含量測定方法，全面、客觀地控制藥材質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器

美國Waters E2695高效液相色譜儀（包括樣品處理器、四元泵處理器、PDA檢測器、柱溫箱、Empower色譜工作站）；超聲波清洗機(jī)SB25-12DT（寧波新芝生物科技股份有限公司）；色譜柱Welchrom C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm，月旭科技股份有限公司）；Sartorius BT25S型電子天平（德國賽多利斯公司，感量：0.01 mg）。

1.2 試劑、試藥

乙腈為色譜純（德國Merck公司）；水為Millipore超純水；其他試劑均為分析純。丹酚酸B（批號：111562-201212）、隱丹參酮（批號：110852-200806）、丹參酮IIA（批號：110852-200806）、丹參素鈉（批號：110855-201311）、迷迭香酸（批號：111871-201203）均購自南京春秋生物工程有限公司，純度均＞98%，丹參飲片及藥材均購于各地藥材市場，所有樣品經(jīng)我院藥劑科藥師鑒定，均為唇形科植物丹參的干燥根及根莖。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

取0.5 g丹參藥材粉末，精密稱定，加75%甲醇50 mL，搖勻，超聲處理30 min，提取再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，經(jīng)孔徑0.45 μm濾膜取續(xù)濾液，置于4℃冰箱避光保存。

2.2 混合對照品容液

精密稱定適量對照品（丹參素鈉、丹酚酸B、迷迭香酸、隱丹參酮、丹參酮ⅡA），加75%甲醇制成混合對照儲備溶液備用，濃度分別為59.5，656.0，346.0，221.0，414.0 μg/mL。

2.3 色譜

色譜柱Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長280 nm；柱溫30℃；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫表，見表1。

表1 梯度洗脫表

2.4 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積值。丹參素鈉為1.23%，迷迭香酸為0.84%，丹酚酸B為0.96%，隱丹參酮為0.83%，丹參酮ⅡA為0.64%，儀器精密度良好。

2.5 線性范圍考察

按“2.3”項色譜條件，取混合對照品溶液1，2，5，10，15，20，40 μL，分別進(jìn)樣，橫坐標(biāo)為X：對照品進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)Y：峰面積積分值，得到各成分的線性回歸方程和線性范圍，見表2。

表2 各成分線性回歸方程和線性范圍

2.6 穩(wěn)定性試驗

于制備后的0，3，6，12，24，48 h，精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，分析計算各組RSD，結(jié)果分別為0.48%，0.71%，0.52%，0.73%，0.55%，表明在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品6份，制備供試品溶液，并按色譜條件進(jìn)行測定，計算丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹參素鈉含量的RSD，分別為0.71%，0.45%，0.72%，1.40%，1.55%，表示測定方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率

取已知含量的丹參粉末，精密加入丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹參素鈉對照品適量，按樣品溶液制備法平行制備6份，進(jìn)行色譜分析，回收率均在98.68%～99.15%，符合要求。結(jié)果見表3.。

表3 加樣回收率測定結(jié)果

2.9 測定樣品

按樣品溶液制備法制備4批不同產(chǎn)地供試品溶液，測定色譜，記錄色譜峰面積，外標(biāo)法測定丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹參素鈉含量[6]，結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測結(jié)果 （mg/mL）

3 討論

因本研究中同時測定丹參中的脂溶性和水溶性兩種成分，目標(biāo)分離成分極性相差較大，所以采用梯度洗脫。結(jié)果表明乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系統(tǒng)洗脫能力強(qiáng)，保留時間比較短，可以使各指標(biāo)良好分離。

參照《中華人民共和國藥典》2010版，對丹參及其提取物質(zhì)量控制指標(biāo)成分進(jìn)行選擇，選定丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、迷迭香酸、丹參素鈉指標(biāo)成分，客觀、全面地控制丹參的藥材質(zhì)量[7]。

綜上所述，本研究建立的反相高效液相色譜法同時測定丹參中5種成分含量，可以較全面控制和反映丹參的藥材質(zhì)量。

[1] 吳學(xué)騁,舒陽,楊睿,等.反相高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地丹參中丹參素的含量[J].湖北中醫(yī)雜志,2014,36(9):68.

[2] 張珺,程月發(fā),張愛兵.丹參膠囊水溶性成分的高效液相色譜指紋圖譜分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2015,34(1):89-94.

[3] 程沛,韓東岐,胡偉慧,等.高效液相色譜法同時測定丹參中10種水溶性和4種脂溶性成分的含量[J].藥物分析雜志,2015,35(6):991-996.

[4] 程巧鴛,郭增喜,陳碧蓮.RP-HPLC法同時測定香丹注射液中5-羥甲基糠醛和酚酸類成分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2015,34(1):95-98.

[5] 刁璇,肖麗和,林亞珠,等.多波長UPLC法同時測定冠心丹參膠囊中三七皂苷R1等5種有效成分的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2015,32(6):445-450.

[6] Luo QL,Nurahmat M,Li MH,et al.Pharmacological investigation of a HPLC/MS standardized three herbal extracts containing formulae (Bu-Shen-Yi-Qi-Tang) on airway inflammation and hypothalamic-pituitaryadrenal axis achmty in asthmatic mice[J].Phytomedicine, 2014,21(11):1439-1450.

[7] 黃小雅,鐘園,黃忠平,等.離子對反相高效液相色譜法同時測定尿液中復(fù)方α-酮酸片的5種有效成分[J].色譜,2015,33(2):169-173.

本文編輯：魯守琴

Simultaneous Determination of Contents of Five Ingredients in Salvia Miltiorrhiza by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography

Hou Chao
(Drug Manufacturing Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhengzhou City, Henan Zhengzhou 450000, China)

Objective：To develop a reverse phased high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for simultaneous determination of contents of five ingredients in Salvia miltiorrhiza. Methods：The contents of five ingredients in salvia miltiorrhiza was determined by RP-HPLC using Welchrom C18column (250 mm × 4. 6 mm, 5 μm), serving acetonitrile (A) -0.1% phosphoric acid (B) as mobile phase for gradient elution. Results：The linear ranges of cryptotanshinone, tanshinone IIA, salvianolic acid, danshensu and rosmarinic acid were 0.420 0～16.800 0 μg, 0.414 0～16.560 0 μg, 0.656 0～26.240 0 μg, 0.059 5～2.380 0 μg and 0.346 0～13.840 0 μg respectively, with a r value of 0.999 9, and RSDs of less than 1.2% (n＝6). The mean recovery rates of samples were 98.68%～99.15%. Conclusion：RP - HPLC is accurate, rapid and reproducible, which may be used for determination of liposoluble and water - soluble ingredients in salvia miltiorrhiza and overall qualtiy control of the drug.

Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC); Salvia Miltiorrhiza; Content Determination

R282.71；R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.018

2017 - 04 - 11

侯超，男，碩士，中藥師。研究方向：中藥制劑與質(zhì)量控制。通訊作者E-mail：18838195935@163.com