HPLC測定瑞格列奈片的含量

何小琳，張穎，董爽，王迷娟

（1.北京協和藥廠，北京 102600；2.北京協和制藥二廠，北京 102600）

HPLC測定瑞格列奈片的含量

何小琳1，張穎1，董爽2，王迷娟1

（1.北京協和藥廠，北京 102600；2.北京協和制藥二廠，北京 102600）

目的：建立瑞格列奈片的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法對瑞格列奈成分進行含量測定。色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：醋酸銨緩沖液（取醋酸銨3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸調pH值至4.0）-甲醇（20∶80）為流動相；流速：1.0 mL/min；檢測波長為243 nm；柱溫為25℃；進樣量為20 μL。結果：瑞格列奈在10～30 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數r為0.999 6；平均回收率為100.4%，RSD為1.22%；24 h內瑞格列奈溶液穩定性良好，RSD為1.08%。結論：本方法操作簡便，結果準確、可靠，可用于瑞格列奈片的含量測定。

高效液相色譜法；瑞格列奈片；含量

瑞格列奈片系德國Boehringer Ingelhei公司研制，由丹麥Novo Nordisk公司開發并于1998年在美國首次上市，商品名為Prandin。2000年在中國上市，商品名為諾合龍[1-2]，主要成份化學名稱為：S（＋）-2-乙氧基-4[2-[[3-甲基-1-[2-（1-哌啶基）苯基]-丁基]氨基-2-氧乙基]苯甲酸，分子式為C27H36N2O4，是非磺酰脲類結構的胰島素分泌促進劑[3-4]，為新型短效口服促胰島素分泌降糖藥，通過與不同受體結合關閉β細胞膜中ATP-依賴性鉀通道而發揮降糖作用[5]，用于飲食控制及運動鍛煉不能有效控制高血糖的2型糖尿病（非胰島素依賴型）患者，具有良好的降血糖效果。可單用或與其他降糖藥合用，如二甲雙胍[6]等，具有廣泛的應用范圍。本文主要研究瑞格列奈片的含量測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀及其工作站（DAD檢測器）；Xs 205電子分析天平（瑞士Mettler公司，精密度為十萬分之一）；色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；瑞格列奈對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100753-200501）；瑞格列奈片為自制片，批號：101103（規格：1.0 mg）；瑞格列奈空白片為自制片，批號：101100。甲醇為色譜純，實驗用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：醋酸銨緩沖液（取醋酸銨3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸調pH值至4.0）-甲醇（20∶80）為流動相；流速：1.0 mL/min；檢測波長：243 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液制備

取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于瑞格列奈1.0 mg），置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液適量，振搖使瑞格列奈溶解，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 對照品溶液制備

取瑞格列奈對照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 μg的溶液。

2.4 系統適用性試驗

取瑞格列奈適量，用磷酸二氫鉀緩沖溶液（取磷酸二氫鉀4.0 g，加水約900 mL溶解后，用磷酸調節pH值至3.2，再加水至1 000 mL）-乙腈（20:80）溶液溶解并制成每1 mL約含1 mg的溶液，置水浴90℃中加熱至溶劑剩余約20%，將樣品加塞密閉置于90℃烘箱繼續加熱24 h，冷卻至室溫，用磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈（20∶80）溶解并稀釋，得系統適用性溶液。取系統適用性溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，降解產物與瑞格列奈依次出峰，其分離度應符合要求。瑞格列奈保留時間為13.5 min，降解產物與瑞格列奈峰分離度為4.3，符合規定。色譜圖見圖1。

圖1 瑞格列奈及瑞格列奈系統適用性HPLC圖

2.5 線性關系考察

取瑞格列奈對照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.1 mg的貯備液。精密吸取貯備液1.0，1.5，2.0，2.5 mL和3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別約為10，15，20，25，30 μg/mL的系列標準溶液。取上述系列標準溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，進樣20 μL，記錄色譜圖。以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，線性回歸，得標準曲線方程

y＝30.473x－8.850 4（r＝0.9996，n＝5）。

結果表明，瑞格列奈濃度在10～30 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.6 儀器精密度實驗

按“2.2”項下供試品溶液制備方法，取供試品溶液1份，按照“2.1”色譜條件測定，連續進樣6次，記錄色譜圖，考察主峰峰面積變化情況，考察儀器精密度。可接受標準：RSD≤2.0%。結果，瑞格列奈峰面積RSD＝0.2%。表明方法儀器精密度良好。

2.7 重復性實驗

按“2.2”項下供試品溶液制備方法，配制6份相同濃度的供試品溶液，按照“2.1”色譜條件測定，記錄色譜圖。同時用對照品溶液進行當中測定，計算6份供試品溶液的含量的相對標準偏差，考察方法的重復性。可接受標準：RSD≤2.0%。結果，含量平均值為101.6%，RSD＝0.55%。

2.8 中間精密度實驗

對同一批次的瑞格列奈片（批號：101103），在不同時間、不同儀器上，由不同實驗員操作，各平行配制6份，測定含量，對數據檢測結果進行統計分析，計算所得12個含量數據的相對標準偏差，驗證其中間精密度。可接受標準：RSD≤2.0%。按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定。結果，含量平均值為100.1%，RSD＝1.81%。表明方法中間精密度良好。

2.9 穩定性實驗

按“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置0，2，4，6，8，10，12，24 h按照“2.1”色譜條件測定，記錄瑞格列奈峰面積。結果，瑞格列奈峰面積RSD＝1.08%。表明，瑞格列奈含量測定供試品溶液在24 h內穩定。

2.10 回收率實驗

精密稱取等量空白輔料，精密加入一定量的瑞格列奈對照品，按“2.2”項下供試品溶液制備方法操作，使最終的樣品中對照品濃度為80%，100%，120%，每個濃度平行操作3份。混合均勻，按“2.1”色譜條件測定，考察檢測方法的準確度。范圍：工作濃度的80%～120%。可接受標準：RSD≤2.0%。回收率結果見表1。

表1 回收率實驗結果（n＝9）

2.11 耐用性實驗

實驗考察了不同柱溫、不同流速、不同流動相比例、流動相A的不同pH值條件，計算瑞格列奈的含量，驗證該方法的耐用性。可接受標準：RSD≤2.0%。結果表明柱溫在±5℃范圍變化、流速在±0.2 mL/min范圍變化、流動相比例在±5%范圍變化、流動相A的pH值在±0.2范圍變化，瑞格列奈含量穩定，RSD均符合規定。該含量測定方法的耐用性良好。

2.12 樣品的含量測定

取“2.2”項下的供試品溶液及“2.3”項下的對照品溶液各20 uL，按“2.1”色譜條件測定。按外標法以峰面積分別計算樣品中的瑞格列奈的含量，平行3份，結果為99.8%，RSD為1.08%。

3 討論

3.1 系統適用性溶液的制備

經實驗，瑞格列奈項下有關物質項中，供試品溶液經90℃水浴中放置24 h并放冷，相對于瑞格列奈峰保留時間約為1.1處的雜質峰未有檢出。考察發現，將有關物質項下供試品溶液置水浴90℃中加熱至溶劑剩余約20%，將樣品加塞密閉置于90℃烘箱繼續加熱24 h，冷卻至室溫，用磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈（20:80）溶解并稀釋，相對于瑞格列奈峰保留時間約為1.1處的雜質峰能夠檢出，符合規定。將按此條件制備的系統適用性溶液用于瑞格列奈片含量測定中，雜質峰檢出明顯，更有利于考察色譜條件的分離效果，確保含量測定結果的準確性。

3.2 檢測波長的選擇

采用Agilent工作站的DAD檢測器全波長對瑞格列奈溶液進行檢測，瑞格列奈在210，243，296 nm波長處有最大吸收，參考輔料峰的大小，選擇243 nm作為檢測波長。

3.3 專屬性考察

按“2.2”項下方法，配置瑞格列奈供試品溶液；同法配制不含主藥的空白輔料溶液。按“2.3”項下方法配置瑞格列奈對照品溶液。分別取空白輔料溶液、供試品溶液和對照品溶液，按“2.1色譜條件”測定。結果，瑞格列奈對照品溶液的色譜圖中主峰的保留時間與供試品溶液中瑞格列奈主峰的保留時間一致；空白輔料溶液色譜圖中在瑞格列奈色譜峰處未見任何相同保留時間的色譜峰。空白輔料溶液對瑞格列奈測定無干擾，方法具有專屬性。

3.4 色譜柱的選擇

實驗比較了不同廠家不同品牌的色譜柱，按“2.4”項下系統適用性實驗進行降解物與瑞格列奈分離度考察。結果，迪馬色譜柱分離效果強，各降解峰均能檢出，降解物與瑞格列奈分離度符合規定。為保證方法的準確、可靠，本實驗規定采用DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行含量分析。

[1] 劉萍.糖尿病治療藥-瑞格列奈[J].國外醫藥-合成藥、生化藥、制劑分冊, 1999,20(4):220-221.

[2] 韓瑩,屠樹滋,王秋娟.治療糖尿病藥物的研究進展[J].中國新藥雜志,2000,9(7):442-448.

[3] 潘曉燕,吳文俊,沈飛霞.瑞格列奈治療中重度初診2型糖尿病的療效和安全性[J].中國臨床藥學雜志,2011,20(1): 24-27.

[4] 劉建朝,嵇汝運.促胰島素分泌杭糖尿病藥物研究進展[J].中國藥學雜志,2005,40(6):408-410.

[5] 王淑梅,楊蓮英,趙合興.口服降糖藥的臨床應用[J].華西藥學雜志,2004,19(2):158-160．

[6] 金紹禮.瑞格列奈聯合二甲雙胍治療初發Ⅱ型肥胖型糖尿病的療效觀察[J].中國藥房,2011,22(20):1876-1877.

本文編輯：魯守琴

Content Determination of Repaglinide Tablets by HPLC

He Xiao-lin1, Zhang Ying1, Dong Shuang2, Wang Mi-juan1
(1. Beijing Union Pharmaceutical Factory, Beijing 102600, China, 2. The Second Union Pharmaceutical Factory of Beijing City, Beijing 102600, China)

Objective：To develop a method for determination of content of repaglinide tablets. Methods：HPLC was used for determination of contents of various components of repaglinide tablets. DIKMA Diamonsil C18(2) column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was adopted serving ammonium acetate buffer (3.85 g ammonium acetate solution dissolved in 1 000 mL of water, of which the pH value was adjusted to 4.0 with acetic acid)-methanol (20∶80) as mobile phase at a fow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 243 nm, while the column temperature was 25℃, and the sample loading was 20 μL. Results：The linear range of repaglinide was 10～30 μg/mL, with a r value of 0.999 6. The average recovery was 100.4%, with a RSD of 1.22%. The repaglinide solution showed good stability within 24 h, with a RSD of 1.08%. Conclusion：This method is simple, accurate and reliable, which is applicable for the quality control of repaglinide tablets.

HPLC; Repaglinide Tablets; Content

R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.019

2017 - 03 - 22

何小琳，化學制藥工程師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：hxlcpu2010@126.com