液相色譜串聯質譜法測定嬰幼兒食品中維生素D3的質量濃度

（廣東出入境檢驗檢疫局，廣州510623）

液相色譜串聯質譜法測定嬰幼兒食品中維生素D3的質量濃度

林海丹，謝守新，鐘鈺，劉超，謝玉珊，丁博，鄒志飛

（廣東出入境檢驗檢疫局，廣州510623）

建立了同位素內標液相色譜串聯質譜法測定嬰幼兒食品中維生素D3質量分數。試樣加同位素內標后，乙醇-50%氫氧化鉀溶液皂化，石油醚萃取，Atlantis T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），甲醇-5 mmol/L甲酸胺溶液作為流動相，梯度洗脫進行液相分離，采用電噴霧正離子方式，多反應選擇離子監測，內標法峰面積定量。嬰幼兒食品中維生素D3質量濃度在2～200 μg/L范圍內線性良好，相關系數r均大于0.99，配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg三個質量分數水平的添加回收率分別為86.1%～107%和86.2%～106%,變異系數分別為4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的定量限為10 μg/kg。方法簡便、準確，適用于嬰幼兒食品中維生素D3的檢測。

液相色譜串聯質譜法；嬰幼兒食品；維生素D3

0 引言

維生素D是一種脂溶性維生素，與人體健康關系密切的是維生素D2（麥角骨化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）。嬰幼兒食品中通常添加的維生素D3作為必需成分，我國也制定了其使用限量標準[1-3]。

食品中維生素D檢測的經典方法是樣品經皂化，萃取凈化后液相色譜法分析，如我國國標方法[4]，但是乳品中維生素D的含量較低，需采用半制備色譜法純化、富集后才能滿足檢測需求，該方法繁瑣，同時也可能有基質干擾，可操作性不強。近年來，選擇性強、靈敏度高的液相色譜-質譜法[5-7]已有應用于維生素D的檢測，如AOAC方法[8]。

本研究采用同位素內標法，高效液相色譜串聯質譜測定嬰幼兒食品中維生素D3，旨在建立一種簡便、準確的定性定量方法。

1 實驗

1.1 材料與試劑

甲醇（HPLC級），石油醚，乙醇，無水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，抗壞血酸，淀粉酶(酶活力≥1 500 U/ g)，維生素D3標準品（純度≥97%），氘代維生素D3標準溶液（維生素D3-[6,19,19-2H3]），100 mg/L，純度≥97%）。

用乙醇配制維生素D3標準溶液（質量濃度10 mg/L），使用前需校正，參見GB 5413.9-2010附錄A。再用乙醇逐級稀釋維生素D3標準溶液配成2～200 μg/L的維生素D3標準工作液，每毫升標準工作溶液含有100 ng的氘代維生素D3。

1.2 儀器與設備

AB 4000 QTRAP串聯質譜儀配有電噴霧離子源，島津液相色譜儀(四元低壓梯度輸液泵,自動進樣器,柱溫箱)，AB公司Analyst儀器控制及數據處理軟件，分析天平，恒溫箱，水浴振蕩器，渦旋振蕩器，減壓旋轉蒸發器。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取1 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL約40～50℃的水使，100 μL氘代維生素D3標準溶液（1 mg/L），渦旋混合30 s。淀粉試樣需加入0.4 g淀粉酶，渦旋混合30 s，充氮排出空氣，蓋上瓶蓋。放入恒溫箱中，60℃培養30 min，取出備用。

于上述處理的試樣溶液加入0.4 g抗壞血酸，加12 mL乙醇，渦旋混合30 s，加入5 mL質量分數為50%氫氧化鉀水溶液，渦旋混合30 s，充氮排出空氣，蓋上瓶蓋，置于75℃水浴振蕩40～50 min，取出立即冷卻至室溫。用少量飽和氯化鈉水溶液將上述皂化液全部轉入250 mL分液漏斗中，加入30 mL石油醚，輕輕搖動，排氣后蓋好瓶塞，置于分液漏斗振蕩儀劇烈振蕩3 min，靜置分層，收集石油醚層，按上述方法進行第二次萃取，合并石油醚于分液漏斗中，用飽和氯化鈉水溶液洗至近中性，石油醚經裝有脫脂棉和無水硫酸鈉的漏斗過濾至100 mL雞心瓶中，置減壓旋轉蒸發儀，40℃蒸干，立即加入乙醇1 mL，渦旋混合30 s，過0.45 μm濾膜后，供液相色譜質譜LC-MS/MS測定。

1.3.2 色譜及質譜條件

色譜柱為Atlantis T3柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相為甲醇(A)-5 mmol/L甲酸胺(B)，0～2min，A為95%；2.01～7min，A為98%；7.01～10 min，A為95%；流速為0.40 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為10 μL。

質譜條件如表1和表2所示。

表1 電噴霧離子源（ESI）的各參數

2 結果與討論

2.1 同位素的選擇

液相色譜質譜定量分析采用同位素內標法，由于同位素的物理，化學性質相近，在樣品前處理時加入同位素內標，既校正了回收率又同時有效校正質譜分析時的基質效應。

2.2 樣品前處理方法的優化

乳品中維生素D是脂溶性的，經典方法，如國標法和AOAC方法均采用乙醇-氫氧化鉀溶液皂化，皂化時添加抗壞血酸保護維生素D，避免氧化，與國標法相比，本方法采用液相色譜串聯質譜法檢測，靈敏度高，因此本方法減少稱樣量，抗壞血酸加入改為直接添加固體試劑，減少體系的溶劑體積，這樣有利于下一步的皂化。皂化置振蕩器中振搖，體積少，更加振動充分，選擇氣密性好的具塞離心管，避免密封不好帶入氧氣造成維生素D的氧化損耗。提高皂化溫度，實驗表明溫度提高至75℃，維生素D沒損失，而油脂皂化更加徹底，回收率和實際樣品的檢測結果更為準確。

表2 多反應選擇離子監測方式(MRM)的各參數

2.3 質譜條件的優化

比較了APCI和ESI離子源，發現APCI源的維生素D靈敏度和信噪比都不如ESI源，同時對樣品采用不同源分析，考察基質干擾，APCI源沒有明顯改善基質干擾，因此采用ESI電噴霧離子源。

對1 mg/L標準溶液進行母離子和子離子掃描和對其質譜參數優化，結果表明正離子模式監測的靈敏度高。維生素D及其內標的子離子全掃描質譜圖見圖1-圖2。確定的質譜參數后，采用維生素D標準溶液自動進樣，進行優化色譜流動相和離子源氣體的各參數。當分別用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-5 mmol/L甲酸銨，甲酸銨的響應值相對較高，采用乙腈代替甲醇，響應值沒有明顯變化。因此選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨作為流動相，靈敏度足以滿足要求。

圖1 維生素D3的子離子掃描質譜

2.4 質譜碎裂機理解析

對維生素D3質譜子離子掃描獲得碎片進行解析如圖3所示。

2.5 色譜條件的優化

圖2 氘代維生素D3的子離子掃描質譜

圖3 維生素D3的質譜解析

經質譜條件篩選后選用甲醇-5 mmol/L甲酸銨溶液作為流動相，考察其色譜行為，對樣液進行分析，考察峰形，基質干擾等分離問題，試驗梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度。考察不同色譜柱，維生素D3在很多普通C18色譜柱上都可以得到很好的峰形，考察樣液的基質峰與目標峰的色譜分離行為，確定采用waters Atlantis T3柱(100 mm×2.1 mm，粒度3 μm,)，分離效果好。試驗梯度洗脫條件，確定最佳的洗脫梯度，維生素D3標準（50 μg/L）及其內標（100 μg/L）的MRM圖如圖4-圖6所示。

圖4 維生素D3標準m/z 385.4/259.3離子對色譜

圖5 維生素D3標準m/z 385.4/107離子對色譜

圖6 標準內標m/z 388.6/259.2離子對色譜

圖7 配方奶粉內標m/z 388.6/259.2離子對色譜

圖8 配方奶粉m/z 385.4/259.3離子對色譜

圖9 配方奶粉m/z 385.4/107離子對色譜

圖10 米粉m/z 385.4/259.3離子對色譜

圖11 米粉m/z 385.4/107離子對色譜

圖12 米粉內標m/z 388.6/259.2離子對色譜

2.6 線性范圍

用乙醇配成的一系列質量濃度的標準混合工作溶液按實驗的色譜條件進行測定，以分析物與內標物峰面積比(Y)-分析物與內標物質量濃度比(X)作校正曲線，得到線性回歸方程Y=1.17X+0.011，維生素D3質量濃度在2～200 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99。

2.7 回收率、精密度及定量限

用不含維生素D的嬰幼兒配方奶粉（由雀巢公司提供無添加維生素D的配方奶粉）和米粉樣品（市售）進行添加回收和精密度實驗，維生素D3添加定量限水平的多反應監測(MRM)色譜如圖7～圖12所示。配方奶粉和米粉在10，50和100 μg/kg 3個質量分數水平的添加回收率分別為86.1%～107%和86.2%～106%,變異系數分別為4.48%～7.08%和2.10%～4.26%(n=6)。方法的回收率和精密度符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》對檢測方法確認的技術要求對回收率和精密度的要求，結果見表3。

實驗表明樣品中維生素D3在添加10 μg/kg水平時，信噪比（S/N）大于10，且回收率和精密度滿意，因此以10 μg/kg作為方法的定量限。

表3 嬰幼兒食品中維生素D3的添加回收率和精密度(n=6)

2.8 實際樣品分析

對含維生素D3的質控樣品（美贊臣提供的經全球比對定值的樣品）進行測定6次，平均測定值91.0μg/ kg，變異系數為4.30%(n=6)。結果在全球各實驗室定值范圍（72.3～97.0μg/kg）內。

3 結束語

本方法研究建立了嬰幼兒食品中維生素D3的高效液相質譜聯用法。方法的樣品的前處理簡單、易操作、定量準確，適用于嬰幼兒食品中維生素D3的檢測。與國標法比較，儀器的靈敏度提高了，不需采用半制備色譜的方法可以達到檢測的要求，減少試劑的消耗和縮短了檢測時間，同時質譜法的定性的準確性高。與其它同類方法比，采用同位素內標定量，有效降低基質效應和校正回收，定量更準確。

[1]GB 10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》[S].

[2]GB10767-2010《食品安全國家標準較大嬰兒和幼兒配方食品》[S].

[3]GB 10769-2010《食品安全國家標準嬰幼兒谷類輔助食品》[S].

[4]GB 5413.9-2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定》[S]

[5]謝玉珊.謝守新.宋陽.液相色譜-質譜聯用法測定乳品中維生素D3質量濃度[J].中國乳品工業,2015.43(1):33-35.

[6]霍艷敏.王駿.段文增.HPLC-APCI(+)-MS/MS測定乳制品中的維生素D2及D3[J].分析測試學報,2016.35(3):327-331.

[7]朱姜.張鵬.楊嘉.高效液相色譜_串聯質譜法測定奶粉中的維生素A、維生素D、維生素E[J].食品與藥品檢驗,2015.25(11):1733-1735.

[8]AOAC Official Method 2012.11 First,Action 2012《Simultaneous De?termination of Vitamins D2and D3in Infant Formula and Adult/Pediat?ric Nutritional Formula ESI LC-MS/MS》[S].

Determination of Vitamin D3in foods for infants and young children with iso?tope-labeled internal standard by liquid chromatography tandem mass spec?trometry

LIN Haidan，XIE Shouxin，ZHONG Yu，LIU Chao，XIE Yushan，DING Bo，ZOU Zhifei
(Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623,China)

To develop a isotope-labeled internal standard liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method for the determination of vitamin D3in foods for infants and young children.The sample was inoculated with a isotope-labeled internal standard and saponified with ethanol–50%potassium hydroxide，followed by extraction with petroleum ether.The chromatographic separation was per?formed on the Atlantis T3 column(100 mm×2.1 mm，3 μm）,using methanol-5 mmoL/L ammonium formate solution as the mobile phase by gradient elution.The method applied positive electrospray ionization and multiple reaction monitoring mode and quantified with peak ar?ea with internal standard method.A good linearity was obtained for 2～2000 μg/L with a correlation coefficient above 0.99.The average re?coveries from three different were with the range of 86.1%to 107%and 86.2%to 106%respectively in formula and rice flour at spiked levels of 10,50,100 μg/kg.and the relative standard deviations were between 4.48%to 7.08%and 2.60%to 4.26%respectively(n=6).The limit of quantification was 10 μg/kg.This method is simple,accurate and suitable for determination of vitamin D3in foods for infants and young chil?dren.

liquid chromatography tandem mass spectrometry；foods for infants and young children；vitamin D3

TS252.7

：A

：1001-2230（2017）07-0056-04

2017-02-13

林海丹（1970-），女，研究員，主要從事食品化學分析工作。