復合菌種酸奶發酵劑的保存

王丹，朱良工，周水明，張筠

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院,哈爾濱150028；2.黑龍江東方學院，哈爾濱150086；3喬富企業有限公司，上海200235）

復合菌種酸奶發酵劑的保存

王丹1，朱良工1，周水明3，張筠2

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院,哈爾濱150028；2.黑龍江東方學院，哈爾濱150086；3喬富企業有限公司，上海200235）

以復合菌種發酵后的酸奶pH值、黏度及感官評分為指標，研究了不同種類輔料、輔料復配比例、菌種包裝形式對菌種保存的影響，得出了不同輔料對發酵性能的影響由強到弱分別為：麥芽糊精，海藻糖，無水葡萄糖；選用麥芽糊精與海藻糖兩種輔料作為填充輔料進行復配，確定了最佳比例；比較了三邊封包裝和背封包裝對酸奶發酵的影響，確定了最佳包裝形式為背封式包裝。

發酵；發酵劑；保存

0 引言

菌種資源保藏作為食用菌產業的一項基礎工作已受到世界各國的重視，國內外一些高級微生物研究單位均設有菌種保藏機構[1]。在1980年Fran-tisek Kral就開始研究微生物菌種的保藏[2]，Sherf在1943年首次采用礦油保藏法，該方法適用于大多數的真菌，后來被廣泛應用[4]。Castellani[3]在1963年首次使用蒸餾水保藏真菌，并且保持菌種遺傳性狀不發生或盡可能少發生變異[5]。菌種是國家的一類重要資源，保持菌種的優良性能，既可保證菌種的高產穩產，也可提高酸奶的品質[6-7]，其保藏原理是人為創造缺氧、低溫或者干燥的條件，降低菌種的新陳代謝，使其生命活動基本處于停滯或者休眠狀態，停止生長繁殖的菌種，其遺傳物質自然會更加穩定[8]。本文研究了影響菌種保存的各因素，并確定了最佳的菌種保存方法。

1 實驗

1.1 材料與儀器

復合菌種發酵劑（嗜熱鏈球菌、保加利亞桿菌、瑞士乳桿菌），麥芽糊精，無水葡萄糖，海藻糖，白砂糖。

電熱恒溫培養箱DHP-9272，潔凈工作臺VD-1320，全自動高壓滅菌鍋HVE-50；DELTA 320 pH計，電子天平PL2002，實驗型1003高壓均質機，ME5-F精密分析天平，JJ-140W增力電動攪拌器，HH·S11-2S恒溫水浴加熱器，黏度計，冰箱。

1.2 方法

制作添加不同輔料（麥芽糊精、無水葡萄糖、海藻糖）的酸奶發酵劑，分裝成小包，每次可發酵1 L的酸奶，以無輔料添加的可發1 L酸奶的量的發酵劑作為空白對照。分別將每組分裝好的樣品拿出5包放置在4℃的冰箱中貯藏，每組的另外5包放置在室溫（25℃）貯藏，在貯藏后的第1周、第2周、第3周、第4周檢測每組樣品發酵后的酸奶的pH值變化、酸奶的黏度變化及感官評定。篩選出合適的輔料后，進而試驗出恰當的輔料添加量。分別放置不同的溫度下，測其貯藏后每周都要酸奶的pH值變化進行評定。

1.2.1 不同輔料添加對菌種保存的影響

以混有麥芽糊精、海藻糖和無水葡萄糖不同輔料的3菌種（菌種量一定、輔料量一定）作為菌種發酵劑，與無輔料添加的空白對比樣對比，均置于常溫保存，研究不同輔料對發酵劑性能的影響。準備4杯1 L的牛奶，滅菌冷卻后，待溫度達到43℃時，分別將混有麥芽糊精、海藻糖和無水葡萄糖的菌種和空白對比樣接入牛奶發酵，分別編號1#、2#、3#、4#。在43℃的電熱恒溫培養箱中發酵6 h，自第3個小時開始測pH值變化，后熟過夜后取出，測定黏度，進行評定。每周重復一次，重復4周。

1.2.2 不同輔料添加比例對菌種保存的影響

用混有輔料麥芽糊精與海藻糖的添加量分別為1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1的比例的菌種作為菌種發酵劑，研究添加不同比例的輔料對菌種發酵劑性能的影響。準備5杯1 L的牛奶，滅菌冷卻后，待溫度達到43℃時，分別將添加不同比例輔料的菌種發酵劑接入牛奶發酵，分別編號1#、2#、3#、4#、5#。在43℃的電熱高溫培養箱中發酵6 h，自第3個小時開始測pH值變化，進行評定。每周重復1次，重復4周。

1.2.3 不同的保存溫度對菌種保存的影響

研究不同溫度保存的菌種發酵劑對酸奶發酵的影響。準備4杯1 L的牛奶，滅菌冷卻后，待溫度達到43℃時，分別接入相同量的在-18℃、4℃和常溫下的菌種發酵劑到牛奶中，分別編號為1#、2#、3#。在43℃的電熱高溫培養箱中發酵6 h，后熟后，每周測試一次進行對比，測試4周，檢測其酸度的變化。

1.2.4 不同的包裝形式對菌種保存的影響

研究不同包裝的菌種發酵劑對酸奶發酵的影響。準備兩杯1 L的牛奶，滅菌冷卻后，待溫度達到43℃時，分解接入三邊封包裝和背封包裝的相同量的菌種發酵劑到牛奶中，分別編號為1#、2#。在43℃的電熱高溫培養箱中發酵6 h，測pH值變化，過夜后熟后，測黏度并進行感官評定。

1.3 檢測方法

1.3.1 酸奶樣品酸度的檢測

本研究用DELTA 320 pH計對酸奶樣品在發酵過程中的pH值曲線進行檢測。實驗采用發酵過程的酸奶作為介質，自發酵第3個小時開始每隔1 h測1次pH值。

DELTA 320 pH計是利用pH復合電極對被測溶液中氫離子濃度產生不同的直流電位通過前置放大器輸入到A/D轉換器，以達到pH測量的目的，最后由數字顯示pH值。測定值可準確到0.01（pH）的單位。在酸奶發酵過程中，從發酵開始每隔1h測定pH值并記錄下來，繪制曲線。

1.3.2 酸奶樣品總酸的檢測

總酸度是指在食品中的所有酸性成分的總量。它包括沒有離解的酸的濃度和已經離解的酸的濃度。它的大小可以用標準堿性滴定來進行測定，所以又可稱為“可滴定酸度”。總酸的測定用標準堿液滴定食品中的酸，中和生成鹽，用酚酞做指示劑。當滴定終點（pH=8.2，指示劑顯紅色）時，根據耗用的標準堿溶液的體積，計算出總酸的含量。Lee[9]等也通過測定菌種在發酵牛奶過程中的pH值的變化來評價不同菌株的酸化能力，首先，配置0.1 mol/L NaOH標準溶液，稱取4 g的NaOH與96 mL蒸餾水混合震蕩溶解，待其冷卻后，搖勻。配置好后，密封保存，定期標定。配置1%的酚酞指示劑。稱取酚酞1 g溶解于60 mL體積分數為95%的乙醇中，用蒸餾水稀釋至100 mL。變色范圍pH值（8.2～10.0）。在測量時，用燒杯稱取酸奶樣品10 g，攪拌均勻，再稱取20 g水與其混合均勻，加入酚酞指示劑3～5滴。用0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定至淺紅色且30 s不褪色。記錄下消耗的NaOH體積。堿式滴定管在使用前，應先用清水洗凈，檢查是否有漏液，先用標準溶液進行潤洗并排除氣泡，才可使用。

發酵好的酸奶4℃冷藏過夜，后熟后測其總酸，每4天測1次，并繪制曲線，測得最佳貨架期。

1.3.3 酸奶樣品的黏度的測定

用博力飛黏度計檢測用不同產酸菌發酵的酸奶樣品的黏度的變化。將酸奶樣品攪拌均勻，黏度計選用3號轉子，轉子轉速60 r/min，30 s后讀數，分別測每個樣品的黏度，記錄，并繪制曲線。

1.3.4 酸奶樣品的感官評定

感官評定小組由20個人組成，男女各半，其中的12名成員是熟悉酸奶感官評定規則的，且有感官評定經驗的食品企業研發和品控人員組成，8名是由具有感官評定經驗的食品專業學生組成。感官評定小組對的成員要保證有3次以上的品嘗次數，然后打分，以提高結果的可靠性。結果取3次品嘗后的平均值。酸奶樣品在進行感官評定之前要放置在4℃的冰箱里貯存。感官品定要在光線明亮的地方進行，以便觀察酸奶的色澤及外觀。評價室還應設在集體的工作區，便于評價員之間的討論。該評價宜在飯后2～3 h內進行，避免過飽或者饑餓的狀態下進行。評定小組的成員在檢驗前的0.5 h內不能吸煙，不得吃具有強刺激性的食物，在進行評定之前要用純凈水漱口。感官評定小組成員要對不同產酸菌發酵后的酸奶樣品從色澤、香氣、狀態和口感上對其進行評定。在色澤方面，優質酸奶的色澤均勻一致，呈乳白色或稍帶微黃色；次質酸奶的色澤不均，呈微黃色或淺灰色；劣質酸奶的色澤灰暗或出現其他異常顏色。在組織狀態方面，優質酸奶的凝乳均勻細膩，無氣泡，允許有少量黃色脂膜和少量乳清；次質酸奶的凝乳不結實也均勻，有乳清析出；劣質酸奶凝乳不良，有氣泡。在滋氣味方面，優質酸奶有純正的酸奶味，酸甜可口；次質的酸奶香氣較平淡；劣質酸奶有不良滋味。

2 結果與討論

2.1 不同輔料添加對菌種保存的影響的結果

以混有麥芽糊精、海藻糖和無水葡萄糖不同輔料的3包菌種（菌種量一定、輔料量一定）作為菌種發酵劑，與無輔料添加的空白對比樣對比，研究不同輔料對發酵劑性能的影響。結果如圖1-圖3所示。

[35]Hun Sen,“The Royal Government of Cambodia’s Policies for the Second Term 1998 - 2003”, https://www.embassyofcambodia.org.nz/government_old.htm, 1998年11月23日。

圖1 麥芽糊精對菌種發酵劑發酵酸度的影響

圖2 無輔料添加的菌種發酵劑發酵酸度

圖3 不同輔料添加的菌種發酵劑黏度變化

由圖1、圖2可以看出，添加麥芽糊精作為保護劑時，分別存儲1周～4周后，測定發酵6 h的pH值與無輔料添加的發酵pH值基本一致，添加海藻糖和無水葡萄糖的pH值變化趨勢與麥芽糊精基本一致，但添加無水葡萄糖在同等發酵條件下pH值較其他兩種輔料和無輔料添加偏高。添加的輔料對冷凍干燥的菌種發酵劑的存活率會產生一定的影響。麥芽糊精的性質即還原能力主要有DE值來決定，且DE值的大小和其平均的分子量成反比[10]。無水葡萄糖是一類不含結晶水的葡萄糖，為有機化合物[11]。海藻糖是一種安全、可靠的天然糖類，由兩個葡萄糖分子通過1,1-糖苷鍵構成的非還原性糖，對多種生物活性物質都具有非特異性保護作用[12]。由圖3可以看出，采用麥芽糊精、海藻糖、無水葡萄糖作為輔料添加到菌種發酵劑中后，通過與無輔料填充的菌種進行對比，得出麥芽糊精相較于其他兩種輔料來說的對于菌種發酵劑的保護效果最好，最為接近無輔料添加的菌種發酵劑的發酵效果。其次是海藻糖，與麥芽糊精的曲線較為接近。由于無水葡萄糖容易吸潮結塊，不能保證菌種發酵劑的水分在5%以下，會導致膜和細胞壁的損傷。當菌種發酵劑直投到酸奶中發酵時，包埋在菌種外壁的結塊溶解不充分等原因會導致菌種發酵劑細胞的主動運輸受到抑制、營養成分得不到充分的利用，也會使菌種變形抑制存活率降低。因此，使用無水葡萄糖作為添加輔料保護的菌種發酵劑發酵的酸奶從第3周開始在發酵6 h后會出現達不到凝固的效果。麥芽糊精和海藻糖不會出現結塊的現象，亦對菌種的包埋效果更好，在牛乳中的具有較好的分散性，麥芽糊精的黏結和增稠效果也較好，并且具有較好的熱可逆性和伸展性，口感與脂肪極為相似，故可以在酸奶發酵中起到增稠的作用。而且麥芽糊精的泡沫穩定性能也較好。圖3中，與空白樣對比，由于無水葡萄糖在第3個星期開始酸奶已無法凝固，所以黏度差一些。綜上所述，麥芽糊精對菌種的保護作用最好，是菌種的活力幾乎不得到衰減。其次是海藻糖，與麥芽糊精的的保護效果相差無幾。

2.2 不同輔料添加比例對菌種保存的影響的結果

用混有輔料麥芽糊精與海藻糖的添加量分別為1∶9，3∶7，5∶5，7∶3，9∶1的比例的菌種作為菌種發酵劑，研究添加不同比例的輔料對菌種發酵劑性能的影響。結果如圖4所示。

圖4 復配比例為5∶5時對菌種發酵劑發酵酸度的影響

由圖4可以看出，當麥芽糊精與海藻糖的添加比例為5∶5時，發酵速度最快。在保存4周后，菌種的活力依舊不得到衰減，而比例為1∶9、3∶7、7∶3和9∶1時在第4周發酵6 h后均有無法凝固的現象出現，pH值達不到4.70左右。因此麥芽糊精與海藻糖的比例5∶5為最佳復配添加比例。

選用對酸奶發酵劑穩定性效果較好的麥芽糊精和海藻糖作為輔料。選擇兩種輔料配合產生不僅便于酸奶發酵菌種的復配生產，而且有利于減少外界環境對菌種活力的影響。有利于保持菌種活力。根據研究出的在酸奶發酵劑中的最適加入量，進行復配實驗。復合輔料與單體輔料相比有十分顯著的優勢，通過輔料的復合，可以發揮各種單一輔料的互補作用，使各種輔料協同增效。復配輔料對酸奶發酵劑的穩定效果比單一的輔料對酸奶發酵劑的穩定效果好。而且在菌種發酵劑中采用適當比例的輔料，能使菌種的效價不會下降，可保存較長時間。比起因添加輔料而額外增加的成本（如輔料加工設備、熱能消耗，添加酶制劑等費用）來說，其總成本是降低的。大多數輔料都含有可溶性氮和多酚類化合物很少，因此可降低蛋白質和多酚的含量，改善發酵出的酸奶的風味和提高酸奶的非生物穩定性。使用部分輔助原料可增加酸奶中糖蛋白的含量。通過單體實驗已經研究出各種輔料在酸奶發酵劑中的最佳選擇。使用麥芽糊精和海藻糖作為輔料，可調節酸奶的可發酵性糖的比例，保證酸奶的色澤，口味爽快。

圖5 -18℃下保存對菌種發酵劑發酵酸度的影響

圖6 4℃下保存對菌種發酵劑發酵酸度的影響

圖7 常溫下保存對菌種發酵劑發酵酸度的影響

2.3 不同保存溫度對菌種保存的影響的結果

研究不同溫度保存的菌種發酵劑對酸奶發酵的影響。結果如圖5-圖7所示。

由圖5-圖7可以看出，菌種在-18℃下保存，測試4周，每次發酵6 h后酸奶的pH值均在4.5以下，符合正常發酵規律。菌種在4℃保藏條件下，保存4周的菌種與-18℃下保存的菌種活力略有下降，但下降不明顯；在常溫下，保存2周仍有較好菌種性能，但保藏到第3周菌種的活力會有明顯下降。保存第4周菌種性能嚴重退化。菌種在低溫保藏條件下，菌種細胞代謝緩慢，生長處于休眠狀態，菌種保藏時間可適延長，活菌含量隨保存溫度的降低而呈單峰曲線變化。菌種的保存溫度與有效期，與實際生產中的發酵是密切相關的，是菌種大面積擴大使用中的最為關鍵的問題之一。不同保存溫度下的試驗，可為酸奶的生產發酵提供數據，并可充分利用菌種的有效期，安排生產，避免為企業造成損失。因此，菌種保存溫度的最佳方案為-18℃冷凍保存。

2.4 不同包裝形式對菌種保存的影響的結果

研究不同包裝的菌種發酵劑對酸奶發酵的影響。結果如圖8和圖9及表1所示。

圖8 不同包裝形式的菌種發酵酸度的變化

圖9 不同包裝形式的菌種發酵黏度

由圖8和圖9及表1可以看出，背封式包裝的菌種的產酸速度、產黏性能和風味物質的產生效果均優于三邊封的菌種的包裝形式。因為在包裝時，背封式在封口時是背部中間和兩端受熱，使菌種的局部受熱面積會大于三邊封包裝的菌種的局部受熱面積，此熱度恰巧也會激發菌種的活力，使菌種的活力不但不得到衰減反而有多提升。綜上所述，背封式為最佳的菌種包裝形式。

表1 不同包裝形式的菌種發酵的酸奶的感官評定

在工廠中發酵劑的包裝形式不僅對發酵劑產品的外觀有影響，而且對菌種的力價也是有一定的影響。相同的發酵劑，選擇不同的包裝形式對最終發酵劑的保質期也有影響[13]。常用的包裝形式有背封式和三邊封兩種。背封袋也被稱之為中封袋，簡單的講就是在袋體的背面進行封邊的包裝袋。這種形式的包裝可以防潮、防水、防止東西散落、可以重復使用，而且柔韌性非常好，非常方便。三邊封袋，主要是指三邊封口，只留一個開口給用戶裝產品。對于一般的產品來說，兩種包裝形式對產品并無太大影響，但對于菌種發酵劑來說，背封和三邊封是有一定的區別的，因此研究背封和三邊封的包裝形式對發酵劑活力的影響及對工廠生產有著十分重要的意義。通過研究這兩種包裝形式對發酵劑活力的影響，可以了解到最優的包裝形式，以便于工廠生產過程中調整包裝設備、優化生產，使生產的效益達到最大化。

3 結論

本文對菌種發酵劑的保存進行了研究，結果表明：不同的輔料對菌種的發酵劑的保護作用是不同的，麥芽糊精和海藻糖的保護效果較好。最佳的輔料為麥芽糊精、其次是海藻糖、效果最差的為無水葡萄糖選用兩種輔料復配作為菌種保存的保護劑。通過不同比例的復配，麥芽糊精和海藻糖的最佳復配比例為5∶5。通過對菌種發酵劑在不同溫度下，不同時間測試其活力，-18℃最適合菌種保存。通過對不同的菌種包裝形式的菌種發酵劑的產酸速度、產黏特性和產風味效果進行測定，背封式包裝是最佳方案。

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上海普麗盛集團創新產品暨意大利COMAN集團進軍中國市場發布會于吳江召開

2017年7月12日，上海普麗盛集團創新產品發布會暨意大利COMAN集團進軍中國市場發布會在蘇州吳江同里湖大飯店召開。中共金山區委常委、副區長劉健，中國食品與包裝機械協會理事長楚玉峰，中國乳制品工業協會理事長吳秋林，中國奶業協會副秘書長鄧榮臻等領導，以及上海普麗盛集團董事長姜衛東、意大利COMAN集團創始人Bruno Grassani、意大利COMAN集團銷售總監Gianluca Scaramuzza、普華盛副總經理趙振、上海普狄副總經理張晴，以及全國各行業協會、各地客戶代表近400人參加了會議。

上海普麗盛包裝股份有限公司專注于乳品、飲料加工及包裝設備的研發制造。公司秉承技術創新的理念，引進國內外先進的技術和管理模式，以穩健的步伐向全球客戶提供優質的各類設備、包裝材料及整體解決方案，形成了以無菌（超潔凈）灌裝為核心的產業，新近推出了具有自知識產權的系列新品，主要有鉆石大包裝、晶鉆包（方圓包、異形包）、PET或PP瓶果肉乳制品灌裝，以及小型PET無菌冷灌裝生產線。2017年4月，普麗盛成功收購意大利COMAN集團，其作為歐洲知名的乳品及飲料裝備供應商，在無菌或超潔凈灌裝領域處于領先地位。主要產品有無菌（超潔凈）高阻隔HDPE灌裝生產線、提供生產線整合及自動化解決方案。在消費升級、產品多元化的時代，這些產品進入市場將會為中國的乳品材料行業升級換代做出貢獻。

上海普麗盛集團董事長姜衛東在發布會上講到，在普麗盛公司的發展規劃上，堅持以無菌灌裝（或超潔凈灌裝）作為核心技術，以包材配套引領持續增長，以工程總包作為營銷平臺，全面走向國際市場。企業將秉持更高更好的理念——創新驅動、環境友好，并注重包裝創新，進一步助力產業升級。

意大利COMAN集團創始人Bruno Grassani對COMAN集團進行了簡單介紹。意大利COMAN銷售總監Gianluca Scaramuzza講述了無菌灌裝技術及應用，用上星期越的設計理念和產品提高企業的競爭力，擁有無菌灌裝、機器人包裝系統、ADV自動化技術。

普華盛副總經理趙振講解無菌PET技術及應用，公司提供PET灌裝技術，重點服務于無菌冷灌裝、中性、酸性無菌液態產品、中性植物蛋白飲料、乳酸菌含乳飲料、超潔凈灌裝，以及含3～5 mm顆料乳品或飲料產品。公司在PET無菌方面提供的設備有吹瓶機、無菌灌裝機、吹灌旋無菌一體機。此外為客戶提供增值服務。

上海普狄副總經理張晴針對快消品行業自動化倉庫的最佳選擇進行講解，公司的核心業務是后段輸送、機器人應用以及智能倉儲/自動化倉庫。

中共金山區委常委、副區長劉健致辭表示，普麗盛公司于2007年6月成立，是金山區土生土長的骨干民營企業，其擁有的無菌灌裝技術打破外國企業在中國市場的壟斷，位列金山百強企業之一，為金山區的經濟發展做出突出貢獻，為金山區民營企業樹立榜樣，成為實體企業的標桿。此外，各個協會代表針對于普麗盛集團創新產品發布會暨意大利COMAN集團進軍中國市場發布會的成功啟動表示祝賀，并致辭。

Strain preservation research

WANG Dan1,ZHU Lianggong1,ZHOU Shuiming3,ZHANG Yun2
(1.Green Food Science Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150028;2.Heilongjiang Oriental College, Harbin 150086,China；3.Georgefood enterprise co.,LTD，Shanghai 200235,China)

With compound strains fermentation yogurt pH value,viscosity and sensory evaluation as an index.The proportion of different kinds of accessories,accessories,strains of packaging effect on strain preservation.It is concluded that the influence of different excipients on the fermentation performance from strong to weak performance were:maltodextrin,trehalose,anhydrous glucose.We choose maltodextrin and trehalose two kinds of materials as filling materials,and for the two materials with different proportions of the complex determined the best ratio of 1∶1.Compare three edge sealing packing and back sealing effect on yogurt fermentation, to determine the best form for the packing sealing packing.

fermentation;starter cultures;preservation

Q935,TS252.54

：A

：1001-2230（2017）07-0060-05

2016-09-13

王丹（1963-），女，研究員級高級工程師，從事乳品加工技術的研究。

朱良工