“PCR技術原理和應用”考點的復習建議

王銳利

1 理解PCR技術的基本原理及過程，能夠區分PCR技術與細胞內DNA復制的異同

PCR的循環過程分為三部分：模板變性、引物退火、熱穩定DNA聚合酶在適當溫度下催化DNA鏈延伸合成。圖1為大腸桿菌細胞內DNA復制示意圖，與PCR技術相比，二者所用引物在化學本質上的區別是什么？圖中所示的子代DNA中最終不含堿基U，其原因是什么？

如圖，大腸桿菌細胞內DNA復制過程具備了邊解旋邊復制的特點以及半保留復制的方式。而且其中一條子鏈是連續合成，而另一條子鏈是不連續合成的，于是就形成了岡崎片段。胞內RNA引物完成延伸后，被RNA酶水解所形成的缺口再通過DNA連接酶連接起來。PCR過程和胞內DNA復制的異同點見表1。

2 PCR過程中引物設計的相關問題

引物決定PCR擴增產物的特異性和長度。引物設計的原則有：① 引物序列設計要依據擴增目標DNA兩端的部分序列，長度通常為20～30bp，盡量降低引物與非擴增區的同源性；② 引物內部不能存在部分互補序列；③ 兩個引物之間不能存在部分互補序列；④ 引物是從引物的5′向3′方向延伸的，所以引物的5′端可以修飾，但3′端不可以修飾，否則會阻礙向3′方向的延伸。根據這些原則，引物設計的問題可以從以下幾個角度進行命題。

2.1 引物序列的合理性

【例1】 某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（圖2），請問原因分別是什么？

分析與參考答案：根據引物設計原則可知，第一組引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而不能與目的基因上下游的特定序列結合而失效。第二組引物Ⅰ′自身折疊后會出現局部堿基互補配對而失效。

2.2 引物個數的問題（注意和探針個數的問題加以區別）

【例2】 一個目的基因通過PCR技術擴增n次時，總共需要多少個引物。擴增第n次時，又需要多少個引物。

分析這種題型可以借助于DNA的半保留復制模型，可知擴增n次，只有最初的DNA的兩條模板鏈不需要引物，其他DNA鏈均需要引物，所以擴增n次，共需要引物（2n×2-2）個，即（2n-1）對引物。而探針個數的問題，又不能簡單的類比引物個數的問題，如例3。

【例3】 TaqMan探針是qPCR技術中一種常用探針（圖3），其5′末端連接熒光基團（R），3′末端連接淬滅劑（Q）。當探針完整時，R發出的熒光信號被Q吸收而不發熒光。在qPCR擴增過程中，當Taq酶遇到探針時會使探針水解而釋放出游離的R和Q，R發出的熒光信號被相應儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產物數量完全同步（圖4）。

若每分子探針水解釋放的R基團熒光強度為a，加入的目的基因為b個，請根據圖示過程，試用數學公式表示反應體系中熒光信號強度（Rn）與擴增次數（n）之間的關系是什么。

此問對能力的要求比較高，解答此題要明確兩點：① 1個TaqMan探針只與DNA的一條鏈結合（注意有別于1對引物和DNA兩條模板鏈結合），1個目的基因擴增1次，Rn=a，2個目的基因擴增1次，Rn=2a，4個目的基因擴增1次，Rn=4a。② 熒光強度會累積，即疊加下去。以1個目的基因擴增為例：擴增1次，Rn=a；擴增2次，Rn=a+2a；擴增3次，Rn=a+2a+4a；擴增4次，Rn=a+2a+4a+8a；如此擴增n次，Rn=a+2a+22a+23a+…+2n-a=（2n-1）a，所以加入目的基因為b個，Rn=ab×（2n-1）。所以，審題時要注意引物和探針與DNA結合的區別。

2.3 定點突變技術與引物設計

定點突變技術是指通過PCR技術向目的基因片段中引入所需變化。比如，GFP（綠色熒光蛋白）的發光基團是第65～67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸），該發光基團可利用定點突變技術使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可成為藍色熒光蛋白（圖5）。

定點突變第一步得把突變位點設計在引物上，如圖5所示第66位酪氨酸（UAC）換成組氨酸（CAC），可以推導出相應的基因堿基序列由ATG突變為GTG。因此人工合成短DNA引物應包含的序列為AGAGTGCTC。由于突變位點的堿基不能夠與模板鏈互不配對，所以突變位點一般設計在引物的中間位置，從而確保突變位點兩側的序列能夠互不配對，同時還不妨礙3′的延伸，這樣錯配引物仍能引導完成DNA復制。最后，通過觀察熒光蛋白是否發出藍色光來檢驗該定點突變技術是否成功。

3 PCR結果的檢測相關問題分析

3.1 PCR結果與遺傳題

人類的甲型血友病為伴X隱性遺傳疾病，致病基因用字母h表示；粘多糖病、葡萄糖-6磷酸脫氫酶缺乏癥（俗稱蠶豆黃）均為單基因遺傳病，分別有A-a基因及E-e基因控制。圖6為甲、乙家族通婚的遺傳系譜圖，通婚前，甲家族不具有粘多糖致病基因，乙家族不具有蠶豆黃致病基因，且Ⅰ-2不具蠶豆黃致病基因。

【例4】 根據條件可以推知圖譜中，圖譜中蠶豆黃病為伴X染色體隱形遺傳病，粘多糖病為常染色體隱性遺傳病。為了探明Ⅳ-2的病因，醫院對上述遺傳系譜圖中的Ⅲ、Ⅳ代成員的該等位基因片段進行了PCR擴增，然后對擴增產物進行凝膠電泳，電泳的結果如圖7所示。根據電泳結果與遺傳系譜圖，推論Ⅳ-2的無血友病XXY癥的形成原因是什么。

根據原題目中已有的條件，可以判斷電泳結果為2.45 kb是隱性基因，2.5 kb是顯性基因，所以Ⅲ-3的基因型為XHXh。由于Ⅳ-2的細胞中無隱形基因，所以XXY癥形成的原因是Ⅲ-3個體減數第二次分裂姐妹染色單體分離后沒有分開進入兩個子細胞中，而是進入了同一個卵細胞內，從而導致了XXY個體的出現。

3.2 PCR異常結果的分析

【例5】 電泳可以直觀對比DNA的完整性，分子大小不同的DNA在凝膠上遷移速率不同，從而產生不同的條帶。圖8是上述實驗中提取到的總DNA凝膠電泳結果，其中M是已知大小的不同DNA的混合物。實驗結果顯示A、B方法提取的總DNA電泳結果只有一條帶，而C方法有明顯的“拖尾”現象。① 只出現一條帶的原因是什么？② 出現“拖尾”現象的原因是什么？

生物總DNA有多種DNA分子，只形成一條帶說明完整DNA分子的分子量大，不易分離；若DNA分子發生斷裂或降解，生成較多不同大小的相對較小的DNA分子，電泳時略有分離但又不充分，即出現“拖尾”現象。所以答案為：① 甜菜細胞基因組DNA分子都比較大，不容易分離；② DNA發生斷裂或降解，形成許多大小不等的DNA片段。

4 小結

PCR技術是當今世界各國分子生物學研究的重要手段。其內容本身就很抽象，原理更是高中生目前認知水平所難以把握的。高考考綱將其納為一個單獨考點，旨在為高中生進入大學后能夠快速向科研型人才轉變做足鋪墊，教師要引起重視。通過一輪復習，學生對PCR基本的生物學知識點均已重溫了一遍，初步掌握了相關知識之間的關聯，但由于學生的認知水平和能力有限，還不能準確地將零散但又有內在聯系的知識點整合成塊。

在此基礎上，教師可以通過示意圖形象深入地展示了PCR技術的原理和過程、通過羅列PCR引物方面的若干問題介紹了這一塊考查的題型、通過對PCR結果的深入分析，讓學生很好地掌握了PCR原理和PCR操作過程中的注意事項。這樣，二輪復習的目標也就水到渠成了：① 要從全面基礎復習轉入重點復習，對各重點、難點進行提煉和訓練；② 將一輪復習過的基礎知識運用到實戰考題中去，將已經掌握的知識轉化為實際解題能力；③ 把握高考各題型的特點和規律，掌握解題方法，形成應試技巧。