苦瓜多糖的分離純化及抗氧化性的研究

莊培榮

苦瓜作為一種含有多種營養物質的藥食一體的植物，常被用以治療上火導致的咽喉腫痛、眼痛以及糖尿病等疾病。在苦瓜中富含各種微量元素以及以及氨基酸等人體必備的物質，國內外各項研究表明苦瓜具有降糖降脂、抗病毒、抗腫瘤以及調整免疫能力等多項生理功能，并力圖對其作用成分進行分析，但并未取得明顯的成效。多糖作為苦瓜中含有的一項重要活性成分之一，與苦瓜的生理作用勢必具有不可分割的聯系。由此對苦瓜中多糖的分析成為了科學界炙手可熱的研究課題，但由于多糖結構復雜，因此相關研究仍然處于不完整的狀態。針對這一現狀，本文對苦瓜多糖的分離純化方法以及其抗氧化性進行了簡要的研究，以期對苦瓜多糖的相關研究起到一定的參考作用。

實驗所需材料與儀器

苦瓜多糖粗產品。苦瓜多糖粗產品指的是采用改良的水提法初步從苦瓜中將多糖進行分離所得出的苦瓜粗多糖。本文所分析的實踐過程即是在這一產品上進行的。

各種實驗所需試劑。要對苦瓜中的多糖進行分離純化，就需要借助相關的試劑進行。這些試劑包含：自制DNS試劑組以及DEAE-cellulose DE52羥甲基纖維素填料、Sephadex G-75 葡萄糖凝膠填料、二苯基苦基苯肼、三氨基甲烷鹽酸鹽等，這些試劑均能對實驗起到重要的輔助作用。

實驗所需儀器。在苦瓜多糖的分離純化以及抗氧化性分析實驗的過程中除了需要用到試管燒杯等一些常用的實驗儀器之外，還需要用到紫外可見分光光度計。這一儀器主要用于觀測光密度（OD值），從而反應分子分布情況，輔助實驗結果觀測。

實驗所用方法

DEAE-cellulose DE52柱分離法。這一方法指的是將準備好的苦瓜粗多糖產品置于固定體積的玻璃柱中，利用蒸餾水將樣品進行溶解，再使用DEAE-cellulose DE52柱對樣品進行層析分離。接著用蒸餾水以及不同含量的NACL溶液對樣本進行洗脫，流速控制為每分鐘0.8ml，每5ml進行一次收集，繼而利用上文所提到的紫外可見分光光度計在486nm時進行OD值的觀測，并制作相應曲線圖，繼而根據曲線圖收集多糖吸收峰值部分的溶液，冷凍干燥得到分離組分。

Sephadex G-75 純化法。將利用上文所述柱分離法進行分離過的樣本進行進一步的處理，將其置于玻璃柱中，利用蒸餾水將其進行溶解。接著用試劑中的Sephadex G-75 葡萄糖凝膠填料對其進行進一步分離純化之后以每小時4ml的速度利用蒸餾水進行洗脫，每2ml收集一管，同樣在486nm時進行OD值觀測，并作出曲線圖。

多糖分子量分布測定法。要想直接觀測多糖的分離純化情況就應當對其分子量分布情況進行觀測。這一方法主要是采用0.02mol/L的磷酸二氫鉀溶液作為流動相，并將其與分離純化之后的樣品進行融合，在將混合液進行高速離心之后，對其上清液進行采集，并利用微孔濾膜對其進行過濾，經過GPC軟件處理之后得出樣品的分子分布量情況。

清除率計算法。本文所述的對苦瓜多糖的抗氧化性的研究主要通過其對DPPH.無水乙醇以及對超氧陰離子自由基的清除率進行反應。在對DPPH.無水乙醇清除率進行檢驗的時候主要采用的是在其中加入苦瓜多糖溶液再注入無水乙醇進行體積填補，而后靜置觀察的方法并在517nm處測試吸光度。而超氧陰離子自由基的清除率的實驗就相對復雜，需要先取用0.03mol/L的三氨基甲烷鹽酸鹽作為緩沖液，對其先進行預熱，而后加入0.05mg/ml的苦瓜多糖溶液以及0.25mol/L的鄰苯三酚溶液混合均勻后再進行水浴，最后用HCL終止反應，在299nm處測試吸光度。雖然二者的實驗過程復雜程度不同，但是其均利用空白溶液作為對照組，且使用的清除率計算公式均為P=（A-B）/A*100% （A、B均為吸光度，A為對照組、B為樣本組）。

實驗結果

分離純化結果。在DEAE-cellulose DE52柱分離法中，蒸餾水洗脫之后未出現明顯峰值，也就是說中性多糖含量低，而用氯化鈉溶液洗脫后得出4個洗脫峰，將其收集并冷凍干燥后，有一組回收率低，因此只選用余下三組利用Sephadex G-75 純化法繼續進行分離純化，出現明顯洗脫峰，再利用DNS試劑進行純度測試，發現其純度達到96%，較分離純化之前的74%有顯著提升。由此可見分離純化效果明顯。

分子量分布結果。在分離純化之前，分子量集中在分隔較遠的兩個部分，而在進行分離純化操作之后集聚在33000Da這一部分，由此可見，經過分離純化之后，苦瓜多糖中的大分子物質以及雜質都得到了減少，進一步證實了純化過程的有效性。

清除率實驗結果。在清除率實驗中，實驗結果顯示，在多糖量達到0.65mg的時候對DPPH.無水乙醇的清除率達到了90%，而在清除超氧陰離子自由基時，其濃度達到0.7mg清除率就達到了100%。且隨著濃度的增加效果不斷顯著。但是在這一峰值之后再增加濃度其效果變化不如達到峰值前顯著，由此可見苦瓜多糖抗氧化效果顯著但具有一定的最適值。

結合上文的實驗研究可知，利用DEAE-cellulose DE52柱分離法以及Sephadex G-75 純化法對苦瓜多糖進行分離純化效果顯著。再結合其清除率可以得知苦瓜多糖的抗氧化效果極佳，但具有效益最大的峰值濃度。因此在往后的苦瓜多糖研究過程中應當更趨向于其最佳效果值的分析，以使其取得最大的科學效益以及經濟效益。