大鼠早期酒精性肝損傷誘導模型的建立及觀察

陳歡　劉燕玲　劉學睿

[摘要目的 探討大鼠早期酒精性肝損傷模型的建立方法，為研究早期酒精性肝損傷的發病分子機制提供理想動物模型。方法 24只雄性SD大鼠隨機分為模型組（16只）和對照組（8只）。對照組飲用自來水；模型組飲用7%～56%梯度遞增的白酒12周。取材前24 h和12 h，分別以56%白酒急性灌胃后處死大鼠。每天記錄大鼠食用飼料量及飲用量；每周稱量大鼠體重。采用全自動生化分析儀測定大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）含量。觀察大鼠肝臟病理學和形態學改變。結果 12周后，模型組大鼠體重增長率為（61.67±1.98）% ，明顯低于對照組的（160.09±3.12）% （P<0.05），肝臟指數模型組（3.74±0.54）高于對照組（2.85±1.26）（P <0.05）。模型組大鼠ALT、AST、TG、TC均較對照組增高（P<0.05），病理學檢查模型組肝組織明顯脂肪變性，伴局部炎癥、壞死。結論 該模型操作簡便，動物死亡率低，穩定，發病過程與臨床類似，是研究早期酒精性肝損傷發病分子機制的理想模型。

[關鍵詞]酒精性肝病；大鼠；肝病模型；肝功能

[中圖分類號] R575 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0007-04

[Abstract]Objective To explore the method of establishing a model of early alcoholic liver disease（ALD） in rats in order to provide an ideal animal model for studying the molecular mechanism of early alcoholic liver injury.Methods Twenty-four male SD rats were randomly divided into experimental group （16 rats） and control group （8 rats）.In the control group，SD rats were fed with tap water.In the experimental group，SD rats were fed with alcohol of which the concentration of 7%-56% increased gradually for 12 weeks.During the experiment，the quantity of the fodder and the value of drinking were recorded everyday.Then the weight was weighed every week.24 and 12 hours before rats in experimental group were killed，they were treated with acute lavages with 56% alcohol.The activities of alanine aminotransferase （ALT），spartate aminotransferase （AST），riglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in serum were determined by the fully automatic biochemical analyser.Moreover，the histological and morphological changes of liver tissues were observed. Results The growth rate of body mass was （160.09±3.12）% in the control group at the end of 12th week，while it was（61.67±1.98）% in the experimental group （P<0.05）.The ratio of liver body weight of the experimental group （3.74±0.54） was obviously increased compared with the control group （2.85±1.26）（P<0.05）.Compared with the control group，the levels of AST，ALT，TG and TC of the model group were clearly increased （P<0.05）.Meanwhile，the typical fatty liver pathologic changes，local inflammation and necrosis were observed in experimental group. Conclusion The results show that the ALD model with low mortality is stable and easy to copy，which is highly similar to the early ALD in human，and can be used in the study of ALD.

[Key words]Alcoholic liver disease；Rat；Liver disease model；Hepatic function

酒精濫用與依賴日益嚴重已成為世界性公共衛生問題。長期大量飲酒易導致酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），早期表現為脂肪肝，可發展為酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化；嚴重酗酒可造成廣泛肝細胞壞死甚至肝衰竭[1-3]。選擇與人類ALD相似的動物模型對研究其發病機制具有重要意義。本實驗建立酒精濃度梯度遞增的白酒長期喂養基礎上高濃度酒精急性灌胃誘導的大鼠肝損傷模型，旨在為ALD建立有價值的研究工具。

1材料與方法

1.1材料

SD雄性大鼠（清潔級）24只[西南醫科大學動物實驗中心提供，SCXK（川）2013-17]，平均體重（200±15）g，飼養條件：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。

1.2主要試劑

56度的北京紅星二鍋頭白酒；HE染色劑：珠海貝索技術有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）試劑盒：南京建成生物有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及處理

24只雄性SD大鼠隨機分為實驗組16只，對照組8只，均標準飼料喂養。對照組飲自來水，模型組飲濃度梯度遞增的白酒12周，每周濃度：7%、14%、18%、22%、26%、30%、34%、45%、56%、56%、56%、56%。

1.3.2 觀察記錄大鼠精神狀態、毛發顏色、飲食量、體重變化、死亡情況

1.3.3 肝組織標本采集與處理

12周末，處死大鼠前24 h和12 h，模型組大鼠給予56度的北京紅星二鍋頭白酒（15 g/kg）灌胃2次，對照組等量生理鹽水灌胃。禁食6 h后，20%烏拉坦（5 ml/kg）麻醉，剖開腹腔，觀察肝臟大小和外觀。10%甲醛灌注固定30 min，分離肝臟，稱取重量；肝門處切取約10 mm×10 mm的組織，10%甲醛固定。

1.3.4大鼠體重增長率及肝臟指數

稱取大鼠體重，體重增長率（%）=（終重量-初始重量）/初始重量×100%。分離肝臟，稱取肝臟濕重，肝臟指數=（肝臟濕重/大鼠體重）×100%。

1.3.5血清學指標檢測

麻醉大鼠后右心房取血，靜置30 min離心。按說明書采用全自動生化分析儀檢測ALT、AST、TG和TC含量。

1.3.6肝臟病理變化及肝細胞形態學變化

肝組織固定后脫水、包埋。常規方法制片，HE染色觀察大鼠肝臟病理學改變，判定肝脂肪變程度（F0～F4）、炎癥程度（G0～G4）和纖維化分級（S0～S4），根據酒精性肝病診療指南[4]分級標準（如下）統計分析。

1.3.6.1酒精性脂肪肝 依據肝細胞脂肪變性占所獲取肝組織標本量的范圍分為4度（F0～F4），肝細胞脂肪變F0：<5%：F1：≥5%～32%；F2：>32%～65%；F3：>65%～75%；F4>75%。

1.3.6.2酒精性肝炎 依據炎癥程度分為4級（G0～G4）：G0無炎癥；G1腺泡3帶呈現少數氣球樣肝細胞，腺泡內散在個別點灶狀壞死和中央靜脈周圍炎；G2腺泡3帶明顯氣球樣肝細胞，腺泡內點灶狀壞死增多，出現Mallory小體，門管區輕至中度炎癥；G3腺泡3帶廣泛的氣球樣肝細胞，腺泡內點灶狀壞死明顯，出現Mallory小體和凋亡小體，門管區中度炎癥伴和（或）門管區周圍炎癥；G4融合性壞死和（或）橋接壞死。

1.3.6.3酒精性肝纖維化 依據纖維化的范圍和形態分為4期（S0～S4）：S0無纖維化；S1腺泡3帶局灶性或廣泛的竇周/細胞周纖維化和中央靜脈周圍纖維化；S2纖維化擴展到門管區，中央靜脈周圍硬化性玻璃樣壞死，局灶性或廣泛的門管區星芒狀纖維化；S3腺泡內廣泛纖維化，局灶性或廣泛的橋接纖維化；S4肝硬化。

1.4統計學方法

采用SPSS 14.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1一般情況

各組大鼠均無死亡。對照組大鼠活潑，毛發光澤，食量正常。模型組食欲減退，毛色發黃，光澤度差，部分大鼠精神狀態較差。模型組飲用液體量和食量均比對照組少。

2.2兩組大鼠體重增長率及肝臟指數的比較

模型組與對照組體重均有上升，與對照組比較，模型組體重增長較慢，后期有降低趨勢。12周后，對照組體重增長率明顯高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組肝臟指數高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3兩組大鼠血清學指標的比較

模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC含量均高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）（表2）。

2.4肝臟病理變化及肝細胞形態學變化

對照組肝臟棕紅色，表面光滑，邊緣銳利，質地柔軟；模型組肝臟色澤較暗，黃褐色，外觀腫大，邊緣圓鈍。HE染色顯示：對照組肝被膜完整，肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊、緊密，胞質豐富，僅有少量脂滴，無明顯變性、壞死及炎癥細胞浸潤（圖1-A）。模型組肝小葉中央區受累明顯，中央靜脈擴張，肝竇擴張，周圍大量肝細胞水樣變性，脂肪變性明顯；有小灶性肝細胞壞死，未見片狀壞死；可見炎細胞浸潤，纖維病變不明顯（圖1-B）。按分級標準計分后統計分析可見，模型組動物肝細胞脂肪變性和炎性病變程度與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組肝細胞纖維性變程度比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表3～5）。

3討論

酒精濫用與依賴現象日漸嚴重，ALD發病率呈逐年上升趨勢。10%～20%的長期大量飲酒者可發生程度不等的ALD，危害身體健康[5]。ALD模型建立與動物種屬、造模方法、條件、時間及實驗目的等多因素密切相關[6]。建立可重復、簡單易行、穩定，且與臨床相似的動物模型對ALD的研究至關重要。

急性酒精灌胃、慢性酒精喂養、胃內喂養等是國內常用的ALD造模方法，其中急性酒精灌胃法較常用[7-10]，但各實驗室在酒精濃度、劑量、灌胃次數等方面無統一標準，且直接灌胃動物死亡率高，模型不穩定。本實驗參照Maricic等[11-12]的方法進行了改良，建立了以酒精濃度梯度遞增白酒長期喂養基礎上高濃度酒精急性灌胃誘導的大鼠ALD模型。該方法與臨床酒精性肝損傷患者發病過程相似，有良好模仿性，簡單易行。

通過對大鼠一般情況、體重增長率、肝臟指數等指標的觀測，實驗組與對照組差異有統計學意義。肝臟是酒精代謝的主要場所，長期過量飲酒可導致肝細胞變性，膜通透性增強，細胞內容物釋放入血，血清酶學改變。ALT、AST是反映肝細胞損傷最敏感的指標[13-14]，其中ALT診斷價值最高[15]，僅1%的肝細胞壞死即可致血清ALT水平升高1倍。當AST值超過ALT時，提示肝實質損害嚴重，為慢性加重標志之一[16]。本實驗模型組血清ALT、AST均顯著高于對照組，說明該造模方式可有效損傷動物肝臟細胞，損壞肝功能。研究發現，酒精可通過產生自由基及脂質過氧化作用造成肝細胞化學性損傷[17-18]。酒精進入機體后，在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶作用下脫氫氧化為乙酸，使肝細胞內還原型輔酶Ⅰ/輔酶Ⅰ（NADH/NAD）比值升高，抑制三羧酸循環，氧化脂肪酸能力下降，TG合成增加，肝細胞脂肪沉積導致細胞脂肪變性[19]。肝臟中蓄積的TG以極低密度脂蛋白（VLDL）形式出肝入血，血清TG含量相應增加，是反映肝損傷的指標之一[20]。本研究發現，實驗動物血清模型組TG、TC均明顯高于對照組，證明該模型成功復制ALD特征。

長期酒精慢性刺激基礎上急性損傷后，模型組大鼠肝臟形態學和病理學檢測均見明顯異常。根據2010年中華醫學會肝病學分會公布的《酒精性肝病診療指南（2010年修訂版）》的組織病理學診斷標準，分級后統計學分析表明模型組動物肝細胞出現明顯脂肪變性和炎性病變，與對照組比較，兩項指標差異均有統計學意義（P<0.05）。而兩組肝細胞纖維性變程度比較，差異無統計學意義（P>0.05），可能與該種造模方式酒精刺激較緩和，時間較短有關。

綜上所述，本實驗成功獲得與人類飲酒習慣及臨床發病特征類似的ALD早期動物模型。該模型穩定，操作簡便且動物死亡率低，為后續實驗靶向早期酒精性肝病的分子機制研究和臨床防治提供較好模型。

[參考文獻]

[1]Gao B，Bataller R.Alcoholic liver disease：pathogenesis and new therapeutic targets[J].Gastroenterology，2011，141（5）：1572-1585.

[2]Bruha R，Dvorak K，Petrtyl J.Alcoholic liver disease[J].World J Hepatol，2012，4（3）：81-90.

[3]周恒，李俊，王華.酒精性肝病動物模型研究進展[J].中國藥理學通報，2016，32（4）：468-472.

[4]中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.酒精性肝病診療指南（2010年修訂版）[J].中華肝臟病雜志，2010， 18（3）：167-170.

[5]Wang FS，Fan JG，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease：the major impact of China[J].Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.

[6]王玲，孫嫵弋，魏偉，等.酒精性肝病動物模型的研究進展[J].安徽醫藥，2010，14（7）：745-748.

[7]郭俊英，劉光亮，李月芬，等.酒精誘發大鼠肝損傷的分子機制與蛋白質組學研究[J].現代醫藥衛生，2012，28（1）：14-17.

[8]李鑫，王晨，聶嬌，等.酒精性肝炎小鼠肝腸組織變化與內毒素血癥的關系探討[J].實用肝臟病雜志，2013，16（3）：254-256.

[9]孫希良，呂冠華，楊杰，等.益肝顆粒對酒精性肝損傷大鼠保護作用的實驗研究[J].中國中西醫結合消化雜志，2014， 22（1）：10-12.

[10]湯小剛，洪汝濤.水提烏藥與醇提烏藥對急性酒精性肝損傷模型大鼠的保護作用[J].中國臨床藥理學雜志，2016， 32（8）：703-706.

[11]Maricic I，Sheng H，Marrero I，et al.Inhibition of type Ⅰ natural killer T cells by retinoids or following sulfatide-mediated activation of type Ⅱ natural killer T cells attenuates alcoholic liver disease in mice[J].Hepatology，2015，61（4）：1357-1369.

[12]Cui K，Yan G，Xu C，et al.Invariant NKT cells promote alcohol-induced steatohepatitis through interleukin-1 beta in mice[J].J Hepatol，2015，62（6）：1311-1318.

[13]萬遠太，陳瑤.Cystatin C在大鼠酒精性肝病中的表達及意義[J].胃腸病學和肝病學雜志，2011，20（7）：624-627.

[14]程海濤.肝臟酶譜對肝病類型及預后的臨床診斷價值研究[J].現代診斷與治療，2015，26（2）：419-420.

[15]袁世偉，鄭衛東.肝臟酶譜檢測在診斷肝病中的應用及其臨床意義[J].臨床和實驗醫學雜志，2012，11（23）：1884-1885.

[16]仝君，童師雯，王丹，等.HBV感染者血清AST/ALT比值及HBV血清標志物聯合檢測的輔助診斷價值研究[J].標記免疫分析與臨床，2011，18（1）：8-11.

[17]曹智麗，周俊英，王娟，等.酒精性肝病大鼠肝組織PPARα表達及意義[J].山東醫藥，2016，56（24）：31-33.

[18]郭麗英，李亞敏，李青春.酒精性脂肪肝大鼠模型肝組織中HIFs/PPAR信號通路激活程度與脂質代謝的關系[J].海南醫學院學報，2015，21（11）：1459-1462.

[19]鄔升，鄭世華，仝巧云.酒精性肝病發病機制的研究進展[J].實用醫學雜志，2013，29（12）：2049-2050.

[20]楊萬枝.酒精性肝病發病機制研究進展[J].安徽醫科大學學報，2012，47（1）：97-99.

（收稿日期：2017-04-12 本文編輯：任 念）