不同性狀荷葉水提液對脂肪酶活性影響比較

王麗娜++許春++皇蓋林++支家華

摘要：目的比較不同性狀荷葉的水提液對脂肪酶活性的影響。方法以橄欖油-聚乙烯醇乳化液為底物，加入荷葉水提液反應20 min，用標準氫氧化鈉溶液滴定反應生成的脂肪酸，用氫氧化鈉消耗的量計算脂肪酶活性。結果不同性狀的荷葉樣品對脂肪酶活性均有不同程度的抑制作用，試驗考察不同產地的七個不同性狀荷葉樣品對脂肪酶活性的抑制作用發現性狀上色淺、較嫩的樣品抑制作用較低。結論關于荷葉對脂肪酶抑制作用的研究中，主要集中在經過純化的生物堿和黃酮類成分，本文直接以水提物為研究對象，通過相對簡便和快捷的方法對荷葉的脂肪酶抑制功能進行評價，為荷葉的采收加工、選材利用和開發提供參考。

關鍵詞：荷葉；性狀；胰脂肪酶；抑制劑

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）08-0082-02

荷葉（Nelumbinis Folium）為睡蓮科植物蓮的干燥葉。荷葉作為藥食同源中藥品種，在藥品、保健食品和普通食品的應用中廣受青睞。《中國藥典》（2015版）一部中共收載了六個配方中使用了荷葉的成方制劑。通過國家食品藥品監督管理局數據查詢檢索，主要原料使用了荷葉的已注冊保健食品多達290余個。原料中使用荷葉的普通食品更是品種繁多，以袋泡茶形式居多。

荷葉的功效研究主要集中在減肥、調節血脂、抗氧化等方面[1][2]。研究顯示荷葉中的生物堿和黃酮類成分都具有抑制脂肪酶活性的作用。朱曉青等人的研究顯示，荷葉粗粉經過石油醚去脂后，用95%乙醇提取，初步純化后得荷葉生物堿粗提物，通過實驗證實其間接改變底物乳化來阻礙底物-酶結合達到抑制作用[3]。霍世欣等研究顯示，荷葉粗粉用60%乙醇回流提取，經石油醚脫脂，再用聚酰胺柱色譜分離得到不同部位的黃酮提取物，其中50%乙醇洗脫部位劑對胰脂肪酶的抑制呈非競爭性抑制[4]。目前有關荷葉功效或藥理研究多以經過提純后的大類成分為主，而荷葉在實際的使用中基本都是以水為溶劑進行粗提就直接利用。荷葉飲片的外觀性狀存在較大出入，因為生長的成熟度不同從青綠色到棕色存在較大差異，針對不同采收季節的荷葉研究其中荷葉堿的含量變化研究顯示不同采收期對荷葉生物堿的含量也有較大影響[5]。而對于荷葉水提取液對脂肪酶活性影響分析的研究少見。

1材料與方法

11材料與試劑荷葉飲片分別采購自云南白藥集團中藥資源有限公司和昆明市官渡區平安藥材經營部，產地及形狀見表1。試劑聚乙烯醇（AR）、無水乙醇（AR）、鹽酸（AR）、脂肪酶（>30000μ/g）、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、氫氧化鈉（AR）采購自昆明福海達化玻儀器有限公司。

12儀器電熱恒溫水浴鍋（XMTD--4000北京市永光明醫療儀廠）、實驗室高剪分散乳化機（上海發孚萊能源技術有限公司，FSL-II）、電子天平（梅特勒）。

13方法

131荷葉水提取液的制備取荷葉飲片，粉碎，精密稱取1 g，加純凈水微沸提兩次，每次均加50 mL，第一次微沸15 min，第二次微沸10 min，兩次濾液和并后定容到50 mL備用。

132脂肪酶活性測定胰脂肪酶催化脂肪分解，生成脂肪酸，以酚酞做指示劑，用標準NaOH溶液滴定生成的脂肪酸，根據所用NaOH的消耗量來計算脂肪酶活力。本實驗設計基于騰宏飛等在橄欖油乳化法測定脂肪酶活性的優化研究[6]內容基礎上確定。

C17H33COOH+NaOH[FY]C17H33COONa+H2O

脂肪酶活力單位定義：在pH 74，40℃條件下每分鐘催化脂肪水解生成1μmol脂肪酸的酶的量，定義為一個酶活力單位。

測定步驟：在100 mL錐形瓶中加入5 mL 0025 mol/L磷酸緩沖液（pH=74）和4 mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液（4%聚乙烯醇（PVA）溶液中按1：100加入橄欖油乳化制成），置于40℃水浴保溫10 min，然后加入1 mL酶液（2 mg/mL），之后再反應15 min，加95%乙醇15 mL終止酶反應。加酚酞2滴，用0025 mol/LNaOH標準溶液滴定至微紅色，記錄NaOH的消耗體積。

空白實驗的酶液在反應終止后加入。通過比較有無抑制劑加入情況下，脂肪酶活力的差異，就可以得到樣品對脂肪酶的抑制率。

控制率=[SX（]脂肪酶活力-抑制后脂肪酶活力[]脂肪酶活力[SX）]×100%

133實驗方法

1331空白組分別取磷酸鹽緩沖溶液4 mL和10%PVA橄欖油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，在40℃水浴中預熱10 min后，計時15 min后，加15 mL95%乙醇終止反應，加1 mL的酶液，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氫氧化鈉來滴定，記錄消耗的體積。

1332對照組分別取磷酸鹽緩沖溶液4 mL和10%PVA橄欖油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，在40℃水浴中預熱10 min后，加1 mL的酶液立即計時15 min后，加15 mL95%乙醇終止反應，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氫氧化鈉來滴定，記錄消耗的體積。

1333供試組分別取磷酸鹽緩沖溶液3 mL和10%PVA橄欖油乳化液4 mL于100 mL的三角瓶中，再加1 mL的供試液，在37度的水浴鍋中預熱10 min后，加1 mL的酶液立即計時15 min后，加15 mL95%乙醇終止反應，加1滴的酚酞，用0025 mol/L氫氧化鈉來滴定，記錄消耗的體積。

2實驗結果與分析

21實驗結果根據13測定方法平行進行3次試驗后取平均值進行脂肪酶活力測定數據。

結果顯示，相同產地的不同性狀樣品對脂肪酶活性的影響程度存在較大差異，本實驗條件下，抑制率最高的結果為4727%，最低的結果為1412%；結合樣品的外觀性狀觀察，性狀上色淺、較嫩的樣品對脂肪酶活性的抑制作用低于性狀上色深、較老的樣品。不同產地的樣品之間同樣存在差異，但產地差異間沒有明顯規律。

22結果分析本實驗情況下上述7個樣品的平均抑制率為3096%。相關研究文獻顯示荷葉總生物堿在在600ug/ml時達到最大抑制率，為256%[7]。分析本文結果與現有研究結果的差距，主要原因可能與本方法直接采用藥材的水提液，沒有對色素等雜質進行去除，所以對滴定終點的顏色觀察存在一定的影響。

3討論

目前荷葉作為藥用飲片使用遵循的是《中國藥典》標準，檢驗項目有性狀、鑒別、水分、總灰分、醇浸出物、荷葉堿含量測定。作為食品原料使用大多遵循的是供銷合作行業標準GH/T 1091《代用茶》標準，檢驗項目有基本要求、感官指標（外觀、湯色、香氣、滋味）、水分、總灰分及衛生指標，而出廠檢驗僅規定了感官、水分和凈含量。在荷葉的實際使用中多采用水煎煮后再按照劑型要求進行制劑，以荷葉功效為主要目的的應用中僅憑現有的標準很難全面評價荷葉原料的質量/功能水平，所以在荷葉的開發利用環節應充分考慮藥效學研究內容。

通過本文實驗中云南和湖南兩地樣品的結果，結合樣品的外觀性狀觀察，性狀上色淺、較嫩的樣品對脂肪酶活性的抑制作用低于性狀上色深、較老的樣品。說明在荷葉的生長過程中對于脂肪酶具有抑制作用的成分發生著變化或轉化，何曉曦等人的研究結果顯示，隨著生長期的延長，生物堿成分之間可能存在一定的生物轉化[5]，所以應結合荷葉總生物堿、荷葉堿、總黃酮等主要成分的情況，以及脂肪酶活性影響的結果才能更好闡釋不同性狀的荷葉在應用中的優劣勢。

本文直接以荷葉的水提液進行試驗研究，通過相對簡便和快捷的方法評價荷葉對脂肪酶活性影響，希望本文的研究對荷葉的開發利用提供一定的借鑒作用，尤其是在荷葉原料的質量控制，原料的篩選和使用方面，同時也為荷葉的采收加工、選材利用和開發提供有益的參考作用。

參考文獻：

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[2]余以剛，陳海光，曾慶孝荷葉水提物清除自由基的ESR研究[J].中草藥200132（8）：693-695

[3]朱曉青，呂敬慈，霍世欣，等荷葉生物堿對胰脂肪酶的抑制作用[J].上海大學學報（自然科學版）200713（2）：85-87，93

[4]霍世欣，周陶憶，司曉晶，等荷葉黃酮化合物對胰脂肪酶抑制作用的研究[J].天然產物研究與開發200820：328-331

[5]何曉曦，孔令提，張澤生，等不同產地和不同采收期荷葉中生物堿的含量變化[J].天然產物研究與開發2013，25：652-655，661

[6]滕宏飛，王丹靜，徐青，等橄欖油乳化法測定脂肪酶活性的優化研究[J].食品工業2011（6）：80-83

[7]范婷婷，法魯克，方芳，等荷葉總生物堿降脂減肥作用的體內外試驗[J].浙江大學學報（農業與生命科學版）210339（2）：141-148