C-myc基因表達及細胞凋亡在脂溢性角化病皮損中的意義

杜鎮，海藝貝，馮世軍，王艷心，王成，李保強

（1.承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000；3.河北省滄州市中心醫院，河北 滄州 061000）

C-myc基因表達及細胞凋亡在脂溢性角化病皮損中的意義

杜鎮1，海藝貝2，馮世軍3，王艷心1，王成1，李保強1

（1.承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000；3.河北省滄州市中心醫院，河北 滄州 061000）

目的 觀察脂溢性角化病（SK）中C-myc基因表達及細胞凋亡情況，探討脂溢性角化病的發病機制。方法 對66例脂溢性角化病皮損及10例正常皮膚組織采用免疫組織化學法檢測C-myc基因表達及原位細胞凋亡檢測（TUNEL）法檢測細胞凋亡情況。結果 兩組性別、年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）；SK組皮損區C-myc基因陽性細胞數百分比（21.94±19.45）%與對照組（0%）相比增加（P＜0.05）；66例SK皮損中有52例C-myc基因表達陽性，對照組中均無陽性表達，兩組陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）；TUNEL凋亡檢測中SK組的凋亡指數（53.01±31.97）與對照組（33.50±23.86）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Spearman相關性分析顯示，C-myc基因在SK皮損中陽性細胞百分比與SK皮損中細胞凋亡指數差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 C-myc基因參與脂溢性角化病的發生發展，脂溢性角化病皮損中細胞凋亡有所增加。該結果對研究其發病機制有一定的指導意義。

脂溢性角化病；免疫組織化學；C-myc基因；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月-2014年12月本院皮膚科就診的66例脂溢性角化病患者，經臨床表現及病理學確診為SK。其中，男性39例，女性27例；平均（55.83±12.91）歲。正常組織10例。男性4例，女性6例；平均（48.00±12.61）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（χ2=0.628，P=0.428；t=1.793，P=0.077）。

1.2 主要試劑與設備

C-myc基因工作液、即用型快捷型免疫組織化學Max VisionTM試劑盒羊抗鼠/兔和二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（均購于福州邁新生物技術開發有限公司），TUNEL凋亡試劑盒（S7100）（購自美國 Millipore公司），S325石蠟切片機（英國Shandon Finesse公司），Wd750ASL23微波爐（廣東省順德格蘭仕集團公司），BX40F4顯微鏡（日本Olympus公司），置入4℃冰箱保存（山東省青島海爾集團公司），粘附載玻片（江蘇省海門世泰實驗器材有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色法 組織切片脫蠟至水，自來水沖洗，3%的過氧化氫H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液熱修復，血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，吹干，中性樹膠封片，鏡檢。以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照組。

1.3.2 脂溢性角化病組織標本的凋亡檢測 石蠟切片常規脫蠟至水，按TUNEL試劑盒說明書進行操作，采用DAB顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，吹干，封片，鏡檢。用在配制末端轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT） 反應液中不加TDT進行標記的組織切片作為陰性對照，用脫氧核糖核酸酶 I（Deoxyribonuclease I，DNase I）處理的組織切片作為陽性對照組。

1.4 結果判定

1.4.1 免疫組織化學結果判定 每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（×400倍），陽性著色為棕黃色顆粒，不著色為陰性。計算5個視野中的陽性細胞數百分比。結果評估根據Fromowitz[3]的綜合計分法進行。在高倍鏡下（10×40）作如下評分：①陽性程度：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。②陽性細胞百分比：＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為 2分；51%～75%為 3分；＞76%為4分。兩項結果相加＜2分為陰性（－）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；6～7分為強陽性（+++）。

其次，農村化學品企業在中國農村地區發展存在“污染天堂效應”。在技術、市場以及資源等其他條件相同的情況下，環境規制對農村化學品企業發展存在顯著的負向影響。此外，農村招商引資優惠、工業資本存量對農村化學品企業的發展有顯著正向影響，技術因素對農村化學品企業發展有顯著負向影響。

1.4.2 TUNEL凋亡檢測結果判定 正常細胞核呈藍黑色，凋亡細胞呈不同程度的棕褐色。每張切片在凋亡細胞區域取5個高倍視野，計算平均每100個細胞中凋亡細胞數，并以百分數（%）表示凋亡指數（apoptosis index，AI）。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用兩獨立樣本t檢驗，計數資料以率（%）表示，用χ2檢驗，相關性分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C-myc基因在SK皮損中的陽性表達

C-myc基因主要在角質形成細胞的細胞核，廣泛分布于棘細胞層及基底層，表現為棕黃色（陽性表達和陰性對照，見圖1、2），正常皮膚組織無表達（見圖3）。SK皮損區C-myc基因陽性細胞數百分比（21.94±19.45）%與正常皮膚組織0%比較增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。C-myc基因在SK皮損區-、+、++ 及 +++ 陽性細胞例數分別為 14、28、22 和2，其陽性率78.79%高于正常皮膚組織0%，差異有統計學意義（χ2=21.436，P=0.000）。

2.2 細胞凋亡情況

TUNEL凋亡檢測中SK皮損組的凋亡指數（53.01±31.97）%與正常皮膚組織（33.50±23.86）%比較，差異無統計學意義（t=1.849，P=0.068）（見圖4、6），陰性對照組（見圖 5、7）。

圖1 C-myc基因在SK皮損中陽性表達（Max Vision×100）

圖2 PBS代替一抗在SK皮損中陰性表達（Max Vision×100）

圖3 C-myc基因在正常皮膚組織中陰性表達（Max Vision×100）

圖4 SK皮損中細胞凋亡情況 （TUNEL×100）

圖5 反應液中不加TDT時SK皮損中細胞凋亡情況（TUNEL×100）

圖6 正常皮膚組織中細胞凋亡情況 （TUNEL×100）

圖7 反應液中不加TDT時正常組織中細胞凋亡情況（TUNEL×100）

2.3 相關性分析

C-myc基因在SK皮損中陽性細胞百分比與SK皮損中細胞凋亡指數相關性差異無統計學意義（r=-0.098，P=0.436）。

3 討論

myc基因家族在許多腫瘤發展中處于重要地位，尤其是C-myc基因作為其中一員在許多惡性腫瘤的增殖與凋亡中發揮著重要的作用。目前，已知C-myc基因在胃癌及食管癌等腫瘤中高表達[4-5]。脂溢性角化病雖為常見的良性皮膚腫瘤，其病理表現為角化過度，角化不全，棘層肥厚，乳頭瘤樣增生，但臨床中也有惡變的報道[6-7]。因此，檢測C-myc基因在脂溢性角化病組織病損中的表達情況，有助于為脂溢性角化病的發病機制提供依據。

實驗結果表明，C-myc基因在SK皮損與正常皮膚組織中差異有統計學意義，這與國外相關報道一致[8]。細胞增殖失控將導致尤其是惡性腫瘤的發生，顯然SK作為良性腫瘤其增殖并非無限，因此實驗采用TUNEL法檢測SK細胞的凋亡情況，研究發現SK細胞凋亡指數與對照組比較差異無統計學意義[9]，但整體發現SK皮損細胞凋亡程度較對照組有所增加。與PESCE等[10]研究較一致，且其認為凋亡增加可能是由于表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）及125I-EGF 聯合下調的結果。另外，張春玲等[11]發現，凋亡基因Fas在SK中的表達較正常表皮細胞早，雖然兩者差異無統計學意義，但作為Fas的配體FasL在SK中比正常表皮表達更明顯。也有不同的報道，AHMED等[12]認為SK的發病機制可能與細胞凋亡受阻有關。有研究證實，作為凋亡抑制蛋白Survivin在SK 病損中高表達[8-9，13]，從本實驗結果推測，SK細胞的凋亡輕度增加與細胞增殖間的相互作用可能是其良性表現的原因。也有研究推測腫瘤抑制基因PTEN部分拮抗Survivin蛋白活性使得SK表現出良性過程[13]。細胞凋亡指數與C-myc基因在SK皮損中陽性細胞百分比相關性無顯著意義。因此，不能表明C-myc基因的表達增加對脂溢性角化病細胞凋亡產生怎樣的影響，但研究發現C-myc基因不僅在SK，而且在原位鱗狀細胞癌（Bowen病）、鱗狀細胞癌中高表達[8]。可見其對腫瘤細胞的增殖可能發揮著重要的作用。雖然脂溢性角化病的發病機制尚不明確，但C-myc基因作為雙向調節腫瘤增殖與凋亡基因在SK皮損中的高表達，必然對該病的發生、發展產生不可忽視的作用。

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Significance of C-myc expression and cell apoptosis in seborrheic keratosis

Zhen Du1,Yi-bei Hai2,Shi-jun Feng3,Yan-xin Wang1,Cheng Wang1,Bao-qiang Li1
(1.The Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Chengde,Hebei 067000,China;2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong 510000,China;3.Cangzhou Central Hospital,Cangzhou,Hebei 061000,China)

ObjectiveTo observe the expression of C-myc and apoptosis in seborrheic keratosis (SK)and investigate the pathogenesis of SK.MethodsImunohistochemistry was used to detect the expression of C-myc,and the apoptosis of cell were detected by TUNEL in 66 SK lesions and 10 normal controls.ResultsThere was no significant difference in gender and age between the two groups(P＞0.05).The percentage of C-myc positive cells(21.94±19.45)%in SK lesions were significantly higher than that in the control groups(0)(P ＜0.05).The protein of C-myc was positively expressed in 52 cases of the 66 SK lesions while none was expressed in the control groups (P＜0.05).There was no significant difference in apoptotic index between SK lesions(53.01±31.97)and the control groups(33.50±23.86)by TUNEL(P＞0.05).There were no significant correlation between the percentage of C-myc protein positive cells and the apoptosis index in SK lesions by spearman analysis (P＞0.05).Conclusions C-myc protein is involved in the occurrence and development of SK,and the apoptosis of SK is increased.

seborrheic keratosis;immunohistochemistry;C-myc;TUNEL

R739.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.008

1005-8982（2017）11-0041-04

2017-02-03

李保強，E-mail：dermlbq@126.com