USP39、EZH2及Sox17在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

戈瑤

（樂山職業技術學院 病理研究室，四川 樂山 614000）

USP39、EZH2及Sox17在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

戈瑤

（樂山職業技術學院 病理研究室，四川 樂山 614000）

目的 探討USP39、EZH2和Sox17在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法 選取90例乳腺癌患者根據臨床病理特征不同，分為原位癌34例、早期浸潤癌41例和浸潤癌15例。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定3組患者的腫瘤組織中USP39、EZH2和Sox17，microRNA自噬基因表達差異。結果 浸潤癌組患者的的腫瘤組織中USP39、EZH2信使核糖核酸（mRNA）表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，Sox17 mRNA表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者；miR-29a、miR-149表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，miR-125b、miR-21和miRNA-26a表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者；自噬基因LC3 mRNA表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者。乳腺癌患者腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量與相關microRNA表達量、自噬基因表達量存在直接相關關系。結論 乳腺癌組織中USP39、EZH2表達升高，Sox17表達量降低且與乳腺癌細胞的增殖、凋亡有關。

乳腺癌；USP39；EZH2；Sox17；自噬

乳腺癌目前在國內發病率增高，早期確診疾病并選擇合理治療方案是優化治療結局的關鍵所在，較多基因異常表達參與乳腺癌的發生，其中USP39、EZH2和Sox17是目前較受關注的3種乳腺癌早期診斷相關基因[1]。國內外研究報道，USP39、EZH2和Sox17異常表達在乳腺癌的發生、發展中扮演重要角色，且原位癌患者也可出現表達量改變，故有學者提出可以將USP39、EZH2和Sox17基因聯合檢測作為乳腺癌早期篩查的新手段[2-3]。本研究選取不同病理特性的乳腺癌患者作為研究對象，通過檢測腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17基因表達量，以及乳腺癌病情相關基因表達情況，以期明確上述3種基因在判斷乳腺癌病情方面的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月-2016年5月在確認乳腺癌并接受手術治療的患者。納入標準：①均經病理活檢確診乳腺癌；②原發性乳腺癌；③既往未接受放化療；④患者知情同意。排除標準：①伴其他臟器原發性惡性腫瘤性疾病；②乳腺癌發生全身轉移；③妊娠或者哺乳期婦女；④臨床資料不完整。

90例乳腺癌患者符合以上入組標準，根據具體術中病理報告分為原位癌34例、早期浸潤癌41例、浸潤癌15例。原位癌組患者年齡42～72歲，平均（58.93±8.12）歲；病灶大小 8～59 mm，平均（23.71±7.09）mm；月經狀態：絕經21例、未絕經13例。早期浸潤癌組患者年齡40～76歲，平均（53.76±8.09）歲；病灶大小 7～62 mm，平均（23.98±7.24）mm，月經狀態：絕經25例、未絕經16例。浸潤癌組患者年齡41～75歲，平均（56.59±8.11）歲；病灶大小 10～67 mm，平均（25.59±7.48）mm，月經狀態：絕經 9例、未絕經6例。3組患者的年齡、腫瘤直徑和絕經狀態分布差異無統計學意義（年齡：F=0.395，P=0.184；腫瘤直徑：F=0.193，P=0.129；絕經狀態：χ2=0.582，P=0.106），具有可比性。

1.2 實驗材料

Trizol試劑（美國賽默飛世爾科技公司），逆轉錄試劑盒以及聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）master mix熒光反應液（浙江省杭州主諾生物技術有限公司），PCR引物由上海生物工程技術有限公司合成。

1.3 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）法測定患者手術所得病灶組織中各基因的表達量，具體方法如下：①總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取、逆轉錄。取10 mg乳腺癌腫瘤組織樣本，碾磨并用Trizol試劑提取總RNA。通過分光光度計檢測提取總RNA的濃度、純度，取吸光度位于1.8～2.1的樣本進入后續試驗。取3 μg上述總RNA，采用逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，將互補脫氧核糖核酸 （complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）樣本置于-20℃冰箱冷凍保存。②qRT-PCR。設計目標基因引物后，進行基因擴增。反應體系：PCR master mix 熒光反應液 10 μl、specific primer set 0.25 μl和cDNA模板2 μl，用去離子水補足至20 μl。PCR反應條件：95℃預變性 3 min，95℃變性 12 s，62℃退火35 s，共40個循環，用儀器自帶軟件對溶解曲線進行分析，以actin為內參，計算目標基因（USP39、EZH2、Sox17、miR-29a、miR-125b、miR-149、miR-218、miRNA-26a、LC3、Beclin1、ATG2B 和 ATG4G）表達量。以原位癌組患者的目的基因mRNA表達量為100，計算早期浸潤癌組、浸潤癌組的相應目的基因mRNA表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用方差分析，相關性分析用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 USP39、EZH2和Sox17表達

早期浸潤癌組患者的腫瘤組織中USP39和EZH2的mRNA表達量高于原位癌組患者，Sox17 mRNA表達量低于原位癌組患者；浸潤癌組患者的的腫瘤組織中USP39和EZH2的mRNA表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，Sox17 mRNA表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者。3組患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量差異有統計學意義（USP39：F3組間=9.385、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=8.281、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=11.284、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=6.978、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.004；EZH2：F3組間=12.581、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=9.392、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=15.028、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=7.393、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.001；Sox17：F3組間=16.312、P3組間=0.000），t原位癌組vs早期浸潤癌組=13.282、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=18.958、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=9.172、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000。見表 1。

表1 3組患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量比較 （±s）

表1 3組患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量比較 （±s）

注：1）早期浸潤癌組與原位癌組比較，P＜0.05；2）浸潤癌組與早期浸潤癌組比較，P＜0.05

組別Sox17原位癌組 34 100±10.17 100±10.54 100±9.37早期浸潤癌組 41 143.25±17.041）154.69±18.151）54.37±6.921）浸潤癌組 15 173.28±20.151）2）214.37±25.731）2）21.83±2.091）2）例數USP39EZH2

2.2 miRNA表達

早期浸潤癌組患者的腫瘤組織中miR-29a、miR-149表達量高于原位癌組患者，miR-125b、miR-218和miRNA-26a表達量低于原位癌組患者；浸潤癌組患者的腫瘤組織中miR-29a、miR-149表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，miR-125b、miR-218和miRNA-26a表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者。3組患者的腫瘤組織miR-29a、miR-149、miR-125b、miR-218 和 miRNA-26a 表達量差異有統計學意義（miR29a：F3組間=13.028、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=10.398、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=14.592、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=8.182、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000；miR-149：F3組間=9.116、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=8.384、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=12.183、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=7.201、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.001；miR-125b：F3組間=10.983、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=8.398、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=13.029、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=7.482、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.001；mi-218：F3組間=14.284、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=11.384、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=17.402、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=8.693、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000；miR-26a：F3組間=11.352、P=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=9.394、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=14.293、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=8.119、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000）。見表 2。

2.3 自噬基因表達

早期浸潤癌組患者的腫瘤組織中LC3 mRNA表達量高于原位癌組患者，Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA表達量低于原位癌組患者；浸潤癌組患者的的腫瘤組織中LC3 mRNA表達量高于原位癌組及早期浸潤癌組患者，Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA表達量低于原位癌組及早期浸潤癌組患者。3組患者的腫瘤組織LC3、Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA表達量差異有統計學意義（LC3：F3組間=8.938、P3組間=0.003，t原位癌組vs早期浸潤癌組=7.985、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=11.039、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=7.119、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.001；Becllin1：F3組間=12.833、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=10.283、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=15.298、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=8.382、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000；ATG2B：F3組間=10.385、P=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=9.228、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=12.856、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=8.172、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000；ATG4G：F3組間=14.582、P3組間=0.000，t原位癌組vs早期浸潤癌組=12.383、P原位癌組vs早期浸潤癌組=0.000，t原位癌組vs浸潤癌組=17.583、P原位癌組vs浸潤癌組=0.000，t早期浸潤癌組vs浸潤癌組=10.282、P早期浸潤癌組vs浸潤癌組=0.000）。見表 3。

表2 3組患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量比較 （±s）

表2 3組患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量比較 （±s）

注：1）早期浸潤癌組與原位癌組比較，P＜0.05；2）浸潤癌組與早期浸潤癌組比較，P＜0.05

組別miRNA-26a原位癌組 34 100±9.32 100±12.18 100±10.73 100±9.74 100±10.56早期浸潤癌組 41 173.25±19.141） 76.51±8.071） 153.62±18.761） 65.38±7.011） 78.34±8.121）浸潤癌組 15 241.28±30.671）2） 34.09±4.121）2） 209.31±22.171）2） 37.94±4.521）2） 40.89±5.481）2）例數miR-29a miR-125b miR-149miR-218

2.4 USP39、EZH2和Sox17與乳腺癌病情的相關性

乳腺癌患者腫瘤組織中USP39、EZH2和Sox17基因表達量與 microRNA（miR-29a、miR-125b、miR-149、miR-218、miRNA-26a）、自噬基因（LC3、Beclin1、ATG2B、ATG4G）表達量呈直接相關性（P＜0.05）。見表4。

表3 3組患者的腫瘤組織自噬基因mRNA表達量比較 （±s）

表3 3組患者的腫瘤組織自噬基因mRNA表達量比較 （±s）

注：1）與原位癌組比較，P ＜0.05；2）與早期浸潤癌組比較，P＜0.05

組別ATG4G原位癌組 34 100±9.32 100±12.18 100±10.73 100±9.74早期浸潤癌組 41 153.67±18.281） 71.47±8.951） 153.62±18.761） 54.69±7.321）浸潤癌組 15 191.19±24.551）2） 39.32±4.761）2） 209.31±22.171）2） 29.76±4.521）2）例數LC3Beclin1ATG2B

表4 USP39、EZH2、Sox17與乳腺癌病情的相關性

3 討論

不同病理特征的乳腺癌生物學特性、腫瘤發展和治療具有均相差甚遠，早期判斷腫瘤分型并制定合理的治療方案是優化臨床治療結局的關鍵所在。隨著對惡性腫瘤的研究深入，較多研究發現腫瘤組織中存在信號轉導通路及相關因子的異常表達，直接參與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移活性的改變，早期發現此類因子并檢測其表達改變成為腫瘤治療指導、預后判斷的新方式。USP39可以促進乳腺癌腫瘤細胞增殖、侵襲等惡性生物學行為，最新研究更是發現USP39可能與惡性腫瘤治療過程中的多重耐藥發生相關。汪小霞[4]已經證實，在乳腺癌組織中EZH2表達量增加，在乳腺癌組織中的陽性表達率為57%左右。Sox17因子是新發現的抑癌基因，較多文獻報道該因子通過抑制Wnt信號傳導通路而參與腫瘤發生[5]。在腫瘤發生初期，Sox17發揮拮抗細胞惡性轉化的作用，隨著Sox17逐步被甲基化，Wnt通路被活化而促使腫瘤進展[6]。本研究首先對上述3種新型基因表達量進行研究，發現隨著乳腺癌細胞浸潤深入增加，腫瘤組織中USP39、EZH2 mRNA表達量增加，Sox17 mRNA表達量降低，提示Sox17基因抑癌作用的降低，USP39、EZH2基因促腫瘤進展的作用增強是乳腺癌發生及浸潤轉移的重要機制，也與既往文獻報道3種基因的作用基本一致。

鑒于USP39、EZH2、Sox17在乳腺癌組織中的表達異常，較多學者認為可以通過3種基因的聯合檢測來作為早期明確腫瘤分期、制定治療方案的基礎，但是目前關于USP39、EZH2、Sox17基因表達對于乳腺癌發展的意義研究仍不多。多種microRNA（mRNA）被發現直接參與乳腺癌發生，通過與靶mRNA特定序列結合、誘導靶mRNA剪切，實現對靶基因的調控并影響腫瘤發展[7]。miR-29a、miR-149、miR-125b、miR-218和miRNA-26a是目前已在國外文獻中報道過，與乳腺癌發生、發展有密切聯系mRNA，miR-29a、miR-149在乳腺癌組織中存在表達上調，而轉染該基因后乳腺癌細胞的增殖及遷移能力均下降[8]。miR-125b在乳腺癌細胞中的表達被一致認為是下調的，扮演抑癌基因角色。miR-218被發現在鼻咽癌中呈低表達，同時可以抑制食管癌細胞的增殖，目前多數學者認為，其在乳腺癌中也呈低表達[9]。miR-26a可下調環氧化酶-2的表達并實現對乳腺癌細胞增殖的抑制，低表達的mRNA-26a提示乳腺癌細胞侵襲性較強[10-11]。本研究發現，浸潤癌組患者的腫瘤組織中 miR-29a、miR-149表達量高于其他2組，miR-125b、miR-218和 mRNA-26a表達量低于其他2組，這與既往文獻報道結果相符，說明具有抑癌作用的mRNA表達量下降、促癌mRNA表達量上升是乳腺癌發生及持續進展的重要原因。

自噬在細胞成分更新、細胞生長分化等多個生理過程中扮演重要角色，是機體在損傷導致微環境改變時的一種防御機制，同時目前多種研究發現細胞自噬活性與腫瘤發生密切相關，自噬成為當下腫瘤學研究的熱點[12]。LC3被認為是自噬的標志分子，目前，發現在大腸癌、口腔鱗狀細胞癌中呈高表達，同時在閆紅[13]的研究中也發現，乳腺癌組織中LC3高表達率高達84.2%。在動物研究中發現，Beclin1基因敲除大鼠的癌癥罹患率大幅高于正常者；有學者發現，在細胞中增強ATG及其輔助因子表達可造成細胞死亡[14-15]。本研究對自噬相關基因LC3、Beclin1、ATG2B和ATG4GmRNA表達量進行檢測，發現浸潤性乳腺癌患者的腫瘤組織中LC3呈高表達，Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA呈低表達，與其他腫瘤中上述基因的表達情況一致，說明自噬基因的異常表達也參與乳腺癌進程中。

為明確USP39、EZH2和Sox17對乳腺癌診斷的價值，本研究最后對USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量與mRNA、自噬基因表達量進行相關性分析，發現乳腺癌患者的USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達量 與 miR-29a、miR-125b、miR-149、miR-218、miR-26a、LC3、Beclin1、ATG2B 和 ATG4G mRNA 表達量存在直接相關性。提示乳腺癌組織中的USP39、EZH2和Sox17基因表達量可以作為患者整體病情嚴重程度評估，預后判斷的可靠手段。

綜上所述，得出以下結論：乳腺癌患者的腫瘤組織USP39、EZH2和Sox17 mRNA表達與具體病情及預后有密切聯系，是乳腺癌標志性基因，有望為日后乳腺癌的診斷、治療服務。

[1]符德元,任傳利,譚好升,等.乳腺癌患者血漿循環DNA中Sox17基因甲基化檢測的臨床意義[J].中國癌癥雜志,2014,24(11):808-811.

[2]FU D Y,TANH S,WEI J L,et al.Decreased expression of SOX17 is associated with tumor progression and poor prognosis in breast cancer[J].Tumor Biology,2015,36(10):8025-8034.

[3]NEUSQUEN L P,FILASSI J R,FRISTACHI C E,et al.EZH2 protein expression and tumor response to neoadjuvant chemotherapy in locally advanced breast cancer[J].Rev Bras Ginecol Obstet.2016,38(6):280-286.

[4]汪小霞,孟剛,李麗,等.乳腺癌中EZH2和p53蛋白表達及其臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(3):273-276.

[5]柳楊,段麗君,萬素芳.卵巢癌組織中Wnt信號通路活性檢測及腫瘤惡性生物學行為的評估[J].海南醫學院學報,2015,21(6):724-727.

[6]程海東,莎仁高娃,陳凜.以鉑類為基礎的新輔助化療療效與胃癌臨床病理特征及泛素特異性蛋白酶39的相關性研究[J].中國全科醫學,2016,19(3):277-280.

[7]NOGALES-CADENAS R,CAI Y,LIN J R,et al.MicroRNA expression and gene regulation drive breast cancer progression and metastasis in PyMT mice[J].Breast Cancer Research,2016,18(1):75.

[8]劉奎,孔繁九,杜善梅,等.miR-29a在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響[J].臨床檢驗雜志,2015,33(11):818-821.

[9]周恩相,肖溪,李靜,等.miR-125b與浸潤性乳腺癌研究進展[J].中國現代醫學雜志,2015,25(13):48-51.

[10]胡綱.miRNA-26a下調COX-2的表達對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響[J].腫瘤防治研究,2015,42(12):1183-1186.

[11]LI M Y,PAN S R,QIU A Y.Roles of microRNA-221/222 in type 2 diabetic patients with post-menopausal breast cancer[J].Genetics&Molecular Research,2016,15(2):15027259.

[12]張雪梅,李宏江,王達,等.自噬相關基因 ATG2B、ATG4D、ATG9B在浸潤性乳腺癌中的表達及臨床意義[J].四川大學學報（醫學版）,2016,47(2):184-188.

[13]閆紅,吳正升,江冬瑞,等.乳腺癌中自噬相關基因LC3與凋亡相關基因XIAP的表達及意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(4):409-411.

[14]洪湘隆,陳岳峰,馬萍璇.黃芩苷對大鼠腦缺血損傷自噬的發生及Beclin-1因子表達的影響[J].海南醫學院學報,2016,22(14):1473-1475.

[15]YEO S K,WEN J,CHEN S,et al.Autophagy differentially regulates distinct breast cancer stem-like cells in murine models via EGFR/Stat3 and Tgf β/smad signaling[J].Cancer Research,2016,76(11):3397-3410.

Expression of USP39,EZH2 and Sox17 in breast cancer tissue and its significance

Yao Ge
(Pathology Laboratory,Leshan Vocational&Technical College,Leshan,Sichuan 614000,China)

ObjectiveTo study the expression of USP39,EZH2 and Sox17 in breast cancer tissue and its significance.MethodsA total of 90 patients with breast cancer were divided into three groups according to different clinical features,34 cases with carcinoma in situ,41 cases with early invasive carcinoma and 15 cases with invasive carcinoma.RT-PCR was used to determine the differences in USP39,EZH2,Sox17,microRNA and autophagy gene expression in tumor tissue of three groups of patients.ResultsUSP39 and EZH2 mRNA expression levels in tumor tissue of patients with invasive carcinoma were higher than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma.Sox17 mRNA expression level was lower than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma.MiR-29a and miR-149 expression levels were higher than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma while miR-125b,miR-218 and miRNA-26a expression levels were lower than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma.Autophagy gene LC3 mRNA expression level was higher than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma while Beclin1,ATG2B and ATG4G mRNA expression levels were lower than those of patients with carcinoma in situ and early invasive carcinoma.USP39,EZH2 and Sox17 mRNA expression levels in tumor tissue of patients with breast cancer were directly correlated with the expression levels of related microRNA and autophagy genes.ConclusionsUSP39,EZH2 and Sox17 mRNA expression intumor tissue of patients with breast cancer are closely related to the specific illness and prognosis,and are the marker genes of breast cancer.

breast cancer;USP39;EZH2;Sox17;autophagy

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.011

1005-8982（2017）11-0054-05

2017-12-27