一株光合細(xì)菌的分離與鑒定

林啟存，朱麗敏，沈小紅，蔡麗娟，戴瑜來，馮曉宇

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024； 2.杭州市市區(qū)河道監(jiān)管中心，浙江 杭州 310006)

一株光合細(xì)菌的分離與鑒定

林啟存1，朱麗敏1，沈小紅2，蔡麗娟1，戴瑜來1，馮曉宇1

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024； 2.杭州市市區(qū)河道監(jiān)管中心，浙江 杭州 310006)

通過富集、純化等方法，從杭州甲魚養(yǎng)殖水體中分離到一株光合細(xì)菌(PSB-1)，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性和16SrRNA基因序列分析，初步確定分離株菌PSB-1為沙氏外硫紅螺菌。

養(yǎng)殖水體； 光合細(xì)菌； 生理生化； 16SrRNA基因

光合細(xì)菌(photosynthetic bacteria，簡稱PSB)是一類以光作為能源，能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物，具有固氮、固碳、降解亞硝酸鹽、脫氫、氧化硫化物等不同種生理生化功能，在自然界的碳、氮、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[1]。

光合細(xì)菌用于養(yǎng)殖水處理已非常普遍，且使用方式以全池潑灑菌制劑為主。菌種是微生態(tài)制劑處理水質(zhì)的核心關(guān)鍵，由于光合細(xì)菌種類多、生理功能多樣，加上不同菌株對水體的適應(yīng)能力或?qū)ξ鬯奶幚砟芰Υ嬖谳^大差異[2]，因此從天然水體中挖掘高活性菌株仍是當(dāng)前光合細(xì)菌的重要研究方向[3-5]。

本研究從甲魚養(yǎng)殖水體富集分離篩選出一株光合細(xì)菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和16SrRNA基因序列分析，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 富集用樣品

富集用水樣采自杭州市西湖區(qū)雙浦鎮(zhèn)某外塘甲魚養(yǎng)殖場。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基。CH3COONa 2 g·L-1+CH3CH2COONa 0.2 g·L-1+NaCl 0.5 g·L-1+NH4Cl 1 g·L-1+MgCl20.1 g·L-1+NaHCO31 g·L-1+K2HPO40.1 g·L-1+CaCl20.01 g·L-1+酵母膏0.05 g·L-1+C2H5OH 0.1 mL·L-1，用磷酸液將pH值調(diào)至7.0。

分離純化培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基中加入15 g·L-1的瓊脂制成固體培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿中。

1.2 富集與分離

取濾網(wǎng)除雜的水樣1 mL于18 mm×180 mm試管中，加經(jīng)滅菌處理的富集培養(yǎng)基至15 mL，混勻，倒入滅菌液狀石蠟封口，并塞上橡膠塞，置(30±1)℃、2 000 lx左右恒溫光照培養(yǎng)箱中2～3周。待液體培養(yǎng)物呈紅色或紅棕色時，吸取1 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至另一裝有新鮮培養(yǎng)液的試管中，重復(fù)上述操作4～5次，使目標(biāo)菌占優(yōu)勢生長。

采用平板劃線法在經(jīng)滅菌處理的光合細(xì)菌純化培養(yǎng)基上接種細(xì)菌。將接種后的培養(yǎng)皿放入裝有厭氧產(chǎn)氣袋的透明培養(yǎng)袋中，密封袋口后倒置培養(yǎng)5～7 d，溫度控制在(30±1)℃、光照強(qiáng)度在2 000 lx左右。待菌落生長起來，挑選紅色或紅棕色單菌落反復(fù)操作2～3次，直至獲得較純的單菌落。

1.3 分離菌株的擴(kuò)培與初篩選

用無菌蒸餾水浸洗純化的菌落，取1 mL菌洗液加到裝有液體培養(yǎng)基18 mm×180 mm試管中，參照富集方法培養(yǎng)至深色，然后取培養(yǎng)液以體積比1∶4的比例接種到裝有富集培養(yǎng)基的250 mL塑料瓶中，密封瓶口，并置恒溫光照下培養(yǎng)7～10 d，至顏色呈深色、D660≥1.5備用。

取培養(yǎng)液接種處理魚塘水樣，分別測定水樣處理前后的COD值、銨氮、亞硝酸鹽氮和總氮，計(jì)算其去除率，比較處理效果，篩選凈化效果相對好的菌株。

COD采用重鉻酸鉀分光光度法測定；銨氮采用納氏試劑分光光度法測定；亞硝酸氮采N-1-萘基-乙二胺光度法測定；硝酸氮采用酚二磺酸紫外分光光度法測定；總氮采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法測定。

1.4 分離菌株的鑒定

1.4.1 菌體形態(tài)觀察

對分離的菌體在載玻片上涂片和革蘭氏染色處理，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 分離菌株生理生化特性分析

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》文獻(xiàn)[6]對分離菌株進(jìn)行生理生化特性鑒定，包括接觸酶、氫化酶、明膠液化、乙酸鈉、丙酸鈉、乳酸鈉、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇、甘油、苯甲酸鈉等試驗(yàn)。

1.4.3 16SrDNA序列分析

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255)提取該菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物對(正向引物fD1：5′-cagagtttgatcctggct-3′，反向引物rp2：5′-aggaggtgatccagccgca-3′)進(jìn)行16SrDNA PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，模板DNA 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃ 4復(fù)性5 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果在NCBI上blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細(xì)菌的富集分離

經(jīng)4次富集和2次純化分離，從水樣中得到菌落形態(tài)相似(濕潤圓形略隆起、邊緣整齊、有光澤)，但顏色、大小不相同的2株細(xì)菌(編號為PSB-1、PSB-2)，PSB-1菌落為紅色、直徑0.5～2.0 mm，PSB-2菌落為淡紅色、直徑0.2～1.0 mm。

2.2 分離菌株的初篩選

以PSB-1、PSB-2為菌株進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，按30%的比例接種母液，培養(yǎng)7～10 d，培養(yǎng)條件同上，至顏色呈深色。取菌液接種處理魚塘水樣，分別測定水樣處理前后的COD值、銨氮、亞硝酸鹽氮和總氮，計(jì)算其去除率，比較處理效果，篩選凈化效果好的菌株。

以截去瓶口的5 L塑料油瓶為試驗(yàn)容器，每瓶取魚塘水3 kg，初始水樣COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮分別為61.00、4.83、1.46、0.43 mg·L-1。于25～30 ℃環(huán)境溫度條件下，試驗(yàn)組每瓶放PSB-1或PSB-2菌液，對照組不放任何菌液，試驗(yàn)周期5 d。試驗(yàn)?zāi)┤「鹘M水樣測定水質(zhì)，其結(jié)果及去除率見表1。

表1 2種菌株培養(yǎng)液對養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

從表1中可看出，PSB-1菌液對水樣COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮的去除效果均比PSB-2菌液好，因此選PSB-1為對象進(jìn)行下一步研究。

2.3 光合細(xì)菌菌株P(guān)SB-1鑒定

2.3.1 菌株P(guān)SB-1的菌體形態(tài)觀察

經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果顯示，菌株P(guān)SB-1呈陰性短桿菌，菌體大小為(1.6～2.0)μm×(0.8～0.9) μm。

2.3.2 生理生化特性

由表2可看出，分離菌株接觸酶試驗(yàn)、氫化酶試驗(yàn)為陽性；明膠液化試驗(yàn)為陰性；可利用乙酸鈉、丙酸鈉、乳酸鈉、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇、甘油，不能利用苯甲酸鈉、酒石酸鉀鈉。

2.3.3 分離菌株16SrRNA基因序列分析

分離菌株擴(kuò)增出的 16SrDNA片段條帶單一，測序后得到長度為1486 bp16SrRNA基因序列：

表2 分離菌株P(guān)SB-1的生理生化特性

注：+表示利用，-表示不利用。

GTTACGACTTCACCCCAGTCATTGACCACACCGTGG TGAACGTCCTCCCGAAGGTTAGACTATCCACTTCTG GTGCAGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTG TACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGC TGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAG TCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACCAGC TTTTTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACC CACTGTACTGGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTG CCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCA CCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAG TTCCCACCCAAAGTGTTGGCAACTAGGGACAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC GACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCA CTCGGTTCCCGAAGGCACTCCCACATCTCTGCAGG ATTCCGAGGATGTCAAGGGCAGGTAAGGTTCTTCG CGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT GTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACC TTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGAACTTAACG CGTTTGCTGCGCCACTAAGAGGTTAAACCCTCCCA ACGGCTAGTTCTCATCGTTTACGGCGTGGACTACC AGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG CAC-TCAGTGTCAGTTTTAGTCCAGAGAGTCGCTT TCGCCACTGGTGTTCCTTCCGATATCTACGCATTTC ACCGCTACACCGGAAATTCCACTCTCCTCTACCAAA CTCTAGCCATGCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTT GAGCCCAGGGCTTTCACATCTGACTGACATCACCAC CTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACG CTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG GAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTGGGTAACGTCAA GTCAGGCACGTATTAGGCACCCGCTTTTCCTCCCC ACTGAAAGTGCTTTACAACCCGCAGGCCTTCTTCAC ACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATT GTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCA TCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGT GGGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCGGACGC AGGCTCATCTGATAGCGCGAGGTCCGAAGAGCC CCCGCTTTCCCCCTTAGGGCGTATGCGGTATTAG CCCGAGTTTCCCCGGGTTGTCCCCCACTACCAGG CAGATTCCTACGCGTTACTCACCCGTCCGCCACTC GTCAGCGCCCGAAGGCCTGTTACCGTTCGACTTG CATGTGTTAAGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGA GCCAGGATCAA。序列對比的結(jié)果表明，所分離的PSB-1菌株與GenBank中Ectothiorhodospirasp.的相似性水平達(dá)99%，結(jié)合本試驗(yàn)2.3.1、2.3.2的結(jié)果與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版)沙氏外硫紅螺菌形態(tài)、大小、生理生化特性基本相符，可初步確定分離菌株為沙氏外硫紅螺菌。

3 小結(jié)

試驗(yàn)從甲魚養(yǎng)殖水體中富集篩選得到一株光合細(xì)菌，編號為PSB-1。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16SrRNA基因序列比對結(jié)果，初步確定該菌株為沙氏外硫紅螺菌。

沙氏外硫紅螺菌是一種以硫化物、分子氫、有機(jī)酸鹽等作為光合電子供體且能利用銨鹽的光能自養(yǎng)菌，本試驗(yàn)條件下，分離菌株培養(yǎng)液對COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮去除率分別達(dá)到57.38%、45.34%、48.63%和27.91%，顯示分離菌株在水質(zhì)凈化方面有較好的應(yīng)用前景。

[1] 武廣，張超峰，呂軍，等. 光合細(xì)菌在對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 中國水產(chǎn)，2006(10)：74-77.

[2] 徐姍楠，邱宏端，林娟，等. 紫色非硫光合細(xì)菌的分離鑒定及其功能研究[J]. 福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，32(2)：246-251.

[3] 林燕玲，劉杰鳳，周天，等. 一株紫色非硫光合細(xì)菌的分離鑒定和培養(yǎng)特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(17)：5-8.

[4] 朱文優(yōu)，周守?cái)ⅲ簳裕? 光合細(xì)菌的分離鑒定及其對廢水凈化效果研究[J]. 成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，33(2)：121-124.

[5] 鄧紅梅，馮霞，駕玉龍，等. 高活性光合細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)及水處理應(yīng)用研究[J]. 食品與發(fā)酵科技，2013，49(2)：17-19，58.

[6] 東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京：科學(xué)出版社，2001.

(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-03-08

浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(2011R50029)；國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-46)

林啟存(1976—)，浙江金華人，高級工程師，碩士，從事水生動物病害防治與水域生態(tài)改良技術(shù)研究工作，E-mail：lqcun@sina.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170845

S917

A

0528-9017(2017)08-1444-03

文獻(xiàn)著錄格式：林啟存，朱麗敏，沈小紅，等. 一株光合細(xì)菌的分離與鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(8)：1444-1446.