急性髓系白血病中環氧化酶-2、野生型P53的相關性分析

陳少微，陳秀花，覃艷紅，徐智芳，許蓮蓉*

(山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001)

急性髓系白血病中環氧化酶-2、野生型P53的相關性分析

陳少微，陳秀花，覃艷紅，徐智芳，許蓮蓉*

(山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030001)

目的 分析環氧化酶-2 (COX-2)和野生型P53(WT-p53)在急性髓系白血病(AML)中表達相關性和意義。方法 采用RT-qPCR檢測COX-2和WT-p53在AML患者中的表達情況。結果 比較21例正常對照、37例初發AML和24例復發AML患者中COX-2 mRNA的相對表達量分別為1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而WT p53 mRNA分別為0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05，均有統計學意義(P＜0.05)。COX-2和WT p53在AML中呈負相關，這與外周血白細胞計數和骨髓原始細胞比例有關。結論 COX-2過表達和WT p53低表達與AML復發有關，炎癥微環境可能通過調控兩者的表達及相互作用導致AML的復發。

白血病，髓樣，急性；環氧化酶-2；野生型P53；復發；炎癥

0 引言

急性髓系白血病(AML)是造血干祖細胞異常增殖和分化障礙所致的惡性克隆性疾病，復發是其治療難題，目前機制尚不明確。研究發現，AML復發可能與炎癥微環境有關[1]，炎癥微環境中存在大量免疫細胞及促炎因子，可激活多種信號通路，這些刺激使環氧化酶-2 (COX-2)表達上調，則基因異常，促進細胞異常增殖、保護細胞免受凋亡等，增加潛在致瘤性。故本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測初發和復發AML患者中COX-2和野生型P53 (WT p53)的表達水平，并研究兩者的表達相關性及與患者臨床特征的關系，旨在探討可能導致AML復發的機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機收集2016年3月至9月我院血液科的骨髓標本共82例。除外急性早幼粒細胞白血病(APL)和行造血干細胞移植的AML患者61例，包括初發組37例和復發組24例；其中男31例，女30例；中位年齡44歲(15-74歲)。診斷標準參照文獻[2]。以21例同期骨髓良性疾病患者為對照組，其中男11例，女10例，中位年齡42歲(20-67歲)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本處理

取患者骨髓標本2ml于EDTA管中，提取單個核細胞，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2 引物設計與合成

Primer Premier 5.0軟件設計RT-qPCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。(表1)

1.2.3 RT-qPCR檢測

取2μl總RNA，按照PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒說明進行逆轉錄，合成cDNA。取2μl的cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒說明配制20μl的擴增體系，ABI7300進行擴增，β-actin為內參照。PCR擴增條件：預變性95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5s變性，60℃ 31s退火延伸，40個循環。每個標本重復3次。Ct值為每個反應體系中熒光信號強度達到預設閾值時的循環數。采用2-ΔΔCt法，相對表達量RQ=2-ΔΔCt，ΔΔCt =(Ct目的基因-Ct內參)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參)對照組。

表1 各基因引物序列

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5軟件。計量資料采用表示。比較資料采用One-Way ANOVA分析及卡方檢驗。相關性采用Pearson相關檢驗。采用t-test檢驗分析兩者與患者臨床特征的關系。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AML中COX-2和WT p53的表達水平

對照組、初發組和復發組中COX-2的相對表達量分別為1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而 WT p53分 別 為 0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05。同對照組相比，AML中COX-2表達增高，WT p53表達下降；和初發組相比，兩者的差異更顯著，有統計學意義(前者χ2=7.544， P=0.023；后者χ2=10.87，P=0.0044) (圖1-2)。

圖1 -2 C O X-2和WT p 5 3在正常組、初發組和復發組的表達水平

2.2 COX-2和WT p53 的表達相關性

對 照 組 中，COX-2和WT p53無 相 關 性(r=0.029，P=0.8985)，初發組和復發組中，兩者均呈負相關(初發組r=0.731，P＜0.0001；復發組r=0.677，P=0.0003) (圖3-5)。

圖3 -5 C O X-2和WT p 5 3在正常組、初發組和復發組的表達相關性

2.3 COX-2、WT p53表達水平與患者臨床特征的關系

AML患者中COX-2、WT p53表達水平與年齡、性別、血小板計數、血紅蛋白濃度均無關（P＞0.05）。復發組中，隨著外周血白細胞計數和骨髓原始細胞比例增高，COX-2表達增高，而WT p53表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；初發組中無此差異（表2）。

表2 C O X-2和WT p 5 3表達水平與患者臨床特征的關系

表2 C O X-2和WT p 5 3表達水平與患者臨床特征的關系

臨床特征 初發組 RQ P值（各組間）≥60且＜90 2.05±0.28 0.49±0.43 4.44±0.56 0.20±0.07≥30且＜60 2.55±0.12 0.39±0.15 5.04±0.18 0.12±0.08 PLT（109/L）≥40 2.13±0.76 0.50±0.35 ＞0.05 3.92±0.19 0.31±0.11 ＞0.05＜40 2.52±0.51 0.44±0.17 4.22±0.56 0.22±0.13骨髓原始細胞比例（%）≥50 3.45±0.68 0.39±0.10 ＞0.05 5.52±0.61* 0.10±0.05* ＜0.05＜50 2.43±0.91 0.55±0.29 4.09±0.21 0.35±0.15復發組RQ P值（各組間）2.96±0.44 0.46±0.12 ＞0.05 4.46±0.08 0.23±0.02 ＞0.05女2.30±0.45 0.33±0.22 5.06±0.45 0.18±0.12年齡≥60 2.53±0.49 0.49±0.32 ＞0.05 4.52±0.39 0.21±0.06 ＞0.05＜60 2.16±0.22 0.44±0.12 4.89±0.22 0.19±0.02 WBC（109/L）≥10 2.52±0.02 0.44±0.43 ＞0.05 5.02±0.41Δ 0.11±0.05Δ ＜0.05＜10 1.99±0.87 0.34±0.22 4.12±0.33 0.39±0.11 HB（g/L）≥90 2.13±0.31 0.44±0.12＞0.05 COX-2 WT p53 COX-2 WT p53性別男4.50±0.21 0.28±0.06＞0.05

3 討論

王曉軍等發現COX-2在慢性粒細胞白血病中表達增高，與腫瘤負荷和病情演變有關[3]。高子芬等也發現在經典型霍奇金淋巴瘤中COX-2過表達率達53.8%，是影響患者無事件生存期的獨立不良預后因素[4]。本研究也證實在AML中COX-2表達增高，且復發組高于初發組，這提示AML復發可能與COX-2過表達有關。

激活COX-2過表達的內源性和外源性刺激，同時也調控WT p53的表達，兩者的啟動子都需通過NF-κB信號轉導通路激活，因此COX-2和WT p53表達存在一定的關聯[5]。Gharghabi等將COX-2抑制劑塞來昔布作用于肺癌細胞株，24小時后發現MDM-2表達下降，WT p53表達上調，說明WT p53/MDM-2負反饋通路被阻斷，抑制肺癌細胞生長；而在48小時后WT p53表達下降，COX-2和MDM-2表達均增加，提示WT p53和COX-2表達存在負反饋調控作用[6]。故本研究對同一研究對象WT p53表達水平進行檢測，發現在AML中WT p53表達是降低的。通過分析COX-2和WT p53表達相關性，發現在AML中兩者確實呈負相關。

通過分析兩者與患者臨床特征的關系，明確外周血白細胞計數和骨髓原始細胞比例的增高是影響COX-2和WT p53負調節的因素。一方面證實COX-2和WT p53相互作用導致白血病細胞增殖，致AML復發；另一方面我們推測COX-2和WT p53的相互作用可能與炎癥有關。在正常炎癥反應中，炎癥病變使NF-κB信號轉導通路激活，致DNA損傷，則WT p53激活致無特異性誘導凋亡，兩者共同上調COX-2的表達，使正常細胞免受WT p53誘導的細胞凋亡；一旦WT p53誘導凋亡作用消失，TATA盒就下調COX-2表達，恢復機體正常生理功能[7]。而AML患者經化療后多免疫功能低下，是慢性非可控性炎癥的易感人群，慢性非可控性炎癥長期作用于機體形成炎癥微環境[8]，處于炎癥微環境下，WT p53和COX-2動態平衡被打破，持續表達的COX-2負反饋調控WT p53表達，而炎癥因子持續反式激活胞苷脫氨酶使TATA盒功能異常[9]，過表達的COX-2發揮炎-癌轉化橋梁作用，誘導體細胞突變；大多數突變體細胞被淘汰，少數則通過體細胞突變和炎癥相關表觀遺傳修飾等改變信號轉導模式，經去分化而獲得干細胞特性，發展為致癌起始細胞[10]，推測白血病干細胞由此而來。故我們推測炎癥微環境激活WT p53后上調COX-2的表達，過表達的COX-2負反饋調控WT p53表達，并發揮炎-癌轉化橋梁作用，致AML復發。

本研究證實，COX-2過表達和WT p53低表達與AML復發有關，而炎癥微環境調控兩者相互作用可能是導致AML復發的機制之一，這為AML復發的研究提供新的思路。

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The Correlation Analysis of COX-2 and WT-p53 Expression in Acute Myeloid Leukemia

CHEN Shao-wei, CHEN Xiu-hua, TAN Yan-hong, , XU Zhi-fang, XU Lian-rong*

The Second Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Taiyuan 030001, China.

Objective To analyze correlation and clinical significance of cyclooxygenase-2 (COX-2) and Wild type p53 (WT-p53) in acute myeloid leukemia (AML). Methods Expression level of COX-2 and WT-p53 was detected by RT-qPCR. Results The average relative quantity of COX-2 mRNA in 21 normal control patients, 37 incipient patients and 24 relapsed patients were 1.09±0.09, 2.36±0.39 and 4.82±0.58, respectively; while that of WT p53 in three groups were 0.99±0.13, 0.48±0.06, 0.20±0.05, respectively. COX-2 expression was negatively correlated with WT p53 expression in AML. This relationship was correlated with peripheral blood leukocyte count and leukemia cell percentage. Conclusions COX-2 over-expression and WT p53 low expression are related to the development of AML. The inflammatory micro-environment may lead to the recurrence of AML by regulating the expression and interaction of both.

Leukemia; Myeloid; Acute; Cyclooxygenase-2; WT p53; Relapse; Inflammation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.08.36