白藜蘆醇增強乳腺癌細胞對γδT細胞的敏感性及其機制研究

黃玲燕

白藜蘆醇增強乳腺癌細胞對γδT細胞的敏感性及其機制研究

黃玲燕

目的探討γδT細胞對乳腺癌細胞的殺傷活性，觀察白藜蘆醇增強γδ T細胞的抗腫瘤活性。方法體外擴增培養人γδT細胞并用流式細胞術進行鑒定。實驗分為對照組、白藜蘆醇組、γδT細胞組、白藜蘆醇+γδT細胞組及白藜蘆醇+γδT細胞+c-FLIP質粒組。LDH釋放實驗檢測γδT細胞對MDA-MB-231乳腺癌細胞的殺傷活性；western blot實驗檢測白藜蘆醇及γδT細胞處理后MDA-MB-231細胞的細胞Fas-相關性死亡結構域樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白（c-FLIP）的表達水平、活化半胱天冬酶（caspase）8、caspase 9、caspase 3的活化和細胞色素c的釋放。結果流式細胞實驗結果顯示在體外用BrHPP和IL-2培養14天的人單個核細胞、CD3和γδTCR，確定這些定向培養的效應細胞為γδT細胞。LDH釋放實驗顯示γδT細胞+白藜蘆醇組對MDA-MB-231的殺傷活性為（68.2±7.1）%，顯著高于γδT細胞組的（21.4±3.2）%（P<0.05）和白藜蘆醇+γδT細胞+c-FLIP質粒組的（27.9±3.6）%（P<0.05）。Western blot實驗結果顯示白藜蘆醇處理能顯著降低MDAMB-231細胞中c-FLIP蛋白的表達，γδT細胞+白藜蘆醇組MDA-MB-231的活化caspase 8及細胞色素c的釋放均顯著高于γδT細胞組和白藜蘆醇+γδT細胞+c-FLIP質粒組。結論白藜蘆醇下調乳腺癌細胞c-FLIP的表達，提高乳腺癌細胞對γδT細胞的敏感性。

乳腺癌；MDA-MB-231細胞；γδ T細胞；白藜蘆醇；c-FLIP基因

乳腺癌是女性群體中發病率最高的惡性腫瘤，而且患者的5年生存率較低，嚴重危害女性健康[1]。手術是目前治療乳腺癌最有效的手段，化療或免疫治療是術后不可缺少的鞏固治療手段[2]。近期的研究已經將一些免疫效應細胞作為藥物進行臨床試驗，用于腫瘤的治療[3]。γδ T細胞是T細胞的一個亞群，其表面的T細胞受體（TCR）由γδ肽鏈組成，能直接殺傷腫瘤細胞而不需要通過MHC分子進行抗原提呈。然而腫瘤細胞對γδ T細胞單獨治療的敏感性較低[4]，因此輔以其它藥物提高乳腺癌細胞對γδ T細胞的敏感性是提高其療效的有效方法。另外，γδ T細胞能直接殺傷腫瘤細胞，導致腫瘤發生裂解，釋放其中的乳酸脫氫酶（LDH），因此檢測培養體系中的LDH活性可用于測定γδ T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性[5]。本研究目的在于探討γδ T細胞對乳腺癌細胞的殺傷活性并研究白藜蘆醇是否能增強γδ T細胞的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料白藜蘆醇購于美國Sigma-Aldrich。乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒和線粒體分離試劑盒購于江蘇碧云天生物技術有限公司。DMEM培養基購于美國Gibco。細胞Fas-相關性死亡結構域樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白（c-FLIP）、活化半胱天冬酶-8（cleaved caspase-8）、活化半胱天冬酶-9（cleaved caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）、細胞色素c和β肌動蛋白（β-actin）抗體購于美國Cell Signaling。ECL試劑盒購于美國Pierce。pcDNA3.1質粒和脂質體2000（Lipofectamine2000）購于美國Invitrogen公司。溴代醇磷酸（bromohydrin pyrophosphate，BrHPP）購于法國Innate Pharma。白細胞介素2（IL-2）購于美國R&D system公司。γδ TCR-PE流式細胞抗體和CD3-FITC流式細胞抗體購于美國BD Bioscience公司。

1.2 細胞培養人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。γδ T細胞的培養按文獻方法[6]，抽取10名健康人的全血采取密度梯度離心法獲取單個核細胞并培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，加入3μmol/L γδ T細胞特異性擴增劑BrHPP和400IU/mL的IL-2培養14天。

1.3 γδ T細胞的鑒別培養的γδ T細胞用帶PE熒光標記的γδ TCR流式細胞抗體和帶FITC熒光標記的CD3流式細胞抗體孵育20min，用生理鹽水將細胞清洗3次后用流式細胞儀進行檢測。

1.4 c-FLIP過表達質粒構建和轉染將c-FLIP基因（Gene ID：NM_001127183.2）的開放閱讀框架序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成c-FLIP重組過表達質粒。c-FLIP過表達質粒用Lipofectamine2000按試劑操作說明書步驟進行轉染，將2μg/mL c-FLIP表達質粒轉染入MDA-MB-231細胞中。

1.5 乳酸脫氫酶釋放實驗檢測γδ T細胞的殺傷活性首先按文獻所示方法[6]將健康人血液中的單個核細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，用γδ T細胞特異性擴增劑BrHPP和IL-2進行體外擴增培養。單個核細胞群體中的γδ T細胞在BrHPP和IL-2的作用下發生增殖。14天后收集細胞，由于只有γδ T細胞高表達CD3和γδ TCR，因此將所收集的細胞用γδ TCR-PE抗體和CD3-FITC抗體進行染色后用流式細胞實驗進行鑒定。如圖1所示，體外培養后獲得的細胞高表達CD3和γδ TCR，確定這些用BrHPP和IL-2體外培養的細胞為γδ T細胞。將γδ T細胞和MDA-MB-231細胞按不同的效靶比（E: T，效應γδ T細胞個數：目標MDA-MB-231靶細胞個數）進行混合共培養。12h后用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒按說明書步驟檢測MDA-MB-231細胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放率。

圖1 γδ T細胞的體外培養鑒別。注：CD3-FITC：異硫氰酸熒光素標記的CD3抗體；γδ TCR-PE：藻紅蛋白標記的γδ鏈T細胞受體抗體

1.6 乳酸脫氫酶釋放實驗檢測白藜蘆醇對γδ T細胞殺傷活性的影響實驗分為對照組、白藜蘆醇組，γδ T細胞組、白藜蘆醇+γδ T細胞組及白藜蘆醇+γδ T細胞+c-FLIP質粒組。對照組為MDA-MB-231細胞單獨培養36h；白藜蘆醇組為MDA-MB-231細胞加入10μmol/mL白藜蘆醇處理36h；γδ T細胞組為MDA-MB-231細胞單獨培養24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231數目的γδ T細胞培養12h；白藜蘆醇+γδ T細胞組為MDA-MB-231細胞加入10μmol/ mL白藜蘆醇處理24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231數目的γδ T細胞培養12h；白藜蘆醇+γδ T細胞+c-FLIP質粒組為MDA-MB-231細胞先用2μg/ mL c-FLIP質粒和10μmol/mL白藜蘆醇處理24h后，再加入2.5倍MDA-MB-231數目的γδ T細胞培養12h。細胞處理完畢后用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒按說明書步驟檢測MDA-MB-231細胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放率。

表1 γδ T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷活性（）

表1 γδ T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷活性（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與1.25倍γδ T細胞組比較，#P<0.05；與2.5倍γδ T細胞組比較，&P<0.05；與5倍γδ T細胞組比較，□P<0.05；LDH：乳酸脫氫酶

組別對照組1.25倍γδ T細胞組2.5倍γδ T細胞組5倍γδ T細胞組10倍γδ T細胞組孔數E:T（γδ T細胞個數：MDA-MB-231細胞個數）3333301.252.5510 LDH釋放率（%）1.6±0.39.5±0.9* 21.2±3.1#50.8±5.1&64.4±6.2□

1.7 線粒體分離將MDA-MB-231細胞按上述進行分組。用線粒體分離試劑盒按試劑說明書步驟將處理后的MDA-MB-231細胞的線粒體從細胞質中分離處理，取細胞質進行后續的Western blot實驗。

1.8 Western blot實驗將MDA-MB-231細胞按上述進行分組。細胞處理完畢后用蛋白提取液提取MDA-MB-231細胞中的總蛋白質。將等量的總蛋白質用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用c-FLIP、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、細胞色素c和β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

2 結果

2.1 γδ T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷活性LDH釋放實驗結果顯示E∶T越高，γδ T細胞對MDA-MB-231細胞殺傷活性越強，且呈γδ T細胞劑量依賴性。見表1。

2.2 白藜蘆醇提高γδ T細胞對MDA-MB-231的殺傷活性γδ T細胞+白藜蘆醇組MDA-MB-231的LDH釋放率顯著高于γδ T細胞組和白藜蘆醇組（P< 0.05），表明白藜蘆醇處理能顯著提高γδ T細胞對MDA-MB-231的殺傷活性。見表2。

2.3 白藜蘆醇通過下調c-FLIP的表達促進γδ T細胞對MDA-MB-231凋亡的誘導western blot實驗結果顯示白藜蘆醇能顯著降低MDA-MB-231細胞中c-FLIP的表達水平（圖2），提示白藜蘆醇對γδ T細胞的增敏作用可能和c-FLIP的下調有關。轉染c-FLIP質粒后γδ T細胞聯合白藜蘆醇對MDA-MB-231細胞的殺傷活性受到明顯抑制，表明白藜蘆醇發揮γδ T細胞的增敏作用的機制是由于c-FLIP的下調。Western blot實驗顯示白藜蘆醇能通過c-FLIP的下調顯著促進γδ T細胞對caspase-8的活化，從而促進γδ T細胞依賴的細胞色素c的釋放和下游casapse-9及caspase-3的活化（圖2）。

表2 白藜蘆醇增強γδ T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷活性（）

表2 白藜蘆醇增強γδ T細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷活性（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與γδ T細胞組比較，#P<0.05；與白藜蘆醇組比較，&P<0.05；與γδ T細胞+白藜蘆醇組比較，□P<0.05；LDH：乳酸脫氫酶

組別對照組γδ T細胞組白藜蘆醇組γδ T細胞+白藜蘆醇組γδ T細胞+白藜蘆醇+c-FLIP質粒組孔數33333 LDH釋放率（%）1.5±0.221.4±3.2* 4.4±0.568.2±7.1.9±3.6□

圖2 白藜蘆醇通過下調c-FLIP的表達促進γδ T細胞對MDA-MB-231凋亡的誘導

3 討論

白藜蘆醇是一種天然存在的多酚類藥物，對多種疾病均有良好的治療效果。近期研究表明，白藜蘆醇還有一定的抗腫瘤效用，能抑制諸如結直腸癌和卵巢癌細胞的增殖和轉移[7-8]。但是，白藜蘆醇是否能增強乳腺癌免疫治療的療效至今還未有確切報道。本研究結果顯示白藜蘆醇能顯著增強γδT細胞對MDA-MB-231乳腺癌細胞的殺傷活性，白藜蘆醇是良好的免疫治療輔助藥物。

以往的研究表明c-FLIP是caspase-8的類似物，能競爭性地抑制caspase-8的功能卻不具備caspase-8的生物活性，因此腫瘤細胞中的c-FLIP是caspase-8依賴的凋亡途徑的抑制蛋白[9-10]。γδT細胞現已考慮作為一種免疫治療藥物進行臨床試驗，γδ T細胞主要通過分泌人凋亡相關因子配體（FasL）和TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導腫瘤細胞死亡。在γδT細胞誘導的細胞凋亡信號通路中，FasL和TRAIL首先使細胞中的caspase-8發生活化[5，11]。活化的caspase-8能誘導線粒體膜電位下降從而使細胞色素C等凋亡誘導物質從線粒體中釋放到細胞質中，進而導致caspase-9和下游caspase-3的活化，最終引起凋亡的發生[12-13]。

本研究結果顯示，白藜蘆醇能顯著下調乳腺癌細胞中c-FLIP這一caspase-8抑制蛋白[14]的表達水平。當用重組真核過表達質粒上調乳腺癌細胞中c-FLIP的蛋白水平后，白藜蘆醇對γδT細胞的協同抗腫瘤作用受到明顯抑制，證明白藜蘆醇是通過降低乳腺癌中c-FLIP蛋白的表達增強γδT細胞依賴的凋亡信號，促使乳腺癌細胞發生caspase-8的活化，從而通過信號轉導導致細胞發生凋亡性死亡。

綜上所述，白藜蘆醇能顯著提高乳腺癌細胞對γδT細胞的敏感性，增強γδT細胞的抗腫瘤活性。這些研究為腫瘤免疫治療提供了更有效的策略和思路。

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（收稿：2017-03-15修回：2017-05-12）

Effect and Mechanism of Resveratrol on Increasing the Sensitivity of Breast Cancer Cells to Cells

HUANG Lingyan Clinical Laboratory,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of resveratrol on enhancing the cytotoxicity of cells to breast cancer and the underlying mechanism.Methods The cellswere amplified in vitroand cell population of was detected by flow cytometry.MDA-MB-231 cells were divided into control group,resveratrol group,cell group,resveratrol+cell group and resveratrol+cell+c-FLIP plasmid group.LDH release assays were performed to evaluate the cytotoxicity of cells to MDA-MB-231.Western blot analysis was performed to evaluate the expression of c-FLIP,activation of caspase 8,caspase 9,caspase 3,Bid and release of cytochrome c in MDA-MB-231 cells.Results Flow cytometry analysis showed that BrHPP and IL-2-cultrued peripheral blood mononuclear cells highly expressed CD3 and CR,thereby these cells were cells.Results of LDH release assays showed that the LDH release rate in cells+ resveratrol group（68.2±7.1）%was significantly higher than that in the cells group[（21.4±3.2）%,P<0.05]and cells+ resveratrol+c-FLIP plasmid group[（27.9±3.6）%,P<0.05].Results of western blot assays showed that resveratrol downregulated the expression of c-FLIP and that activation of caspase 8,caspase 9,caspase 3,Bid and release of cytochrome c was significantly higher than that in the cells group and cells+resveratrol+c-FLIP plasmid group. Conclusion Resveratrolincreased the sensitivity of breast cancer cells to cells through inhibition of c-FLIP expression.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;cells;resveratrol;c-FLIP

book=650,ebook=18

浙江省立同德醫院檢驗科（杭州310012）