膚寧洗劑微生物限度檢查方法的建立及驗證

汪琦 李雄英 吳智娟 黃巧玲

膚寧洗劑微生物限度檢查方法的建立及驗證

汪琦 李雄英 吳智娟 黃巧玲

膚寧洗劑；微生物限度；檢查方法

膚寧洗劑是由黃柏、白鮮皮、白芷、地膚子等中藥制成的復方制劑，具有清熱燥濕、祛風止癢的功效，用于急性皮炎、濕疹伴有滲出或膿性分泌物等治療。按照其用藥途徑，根據2015年版《中國藥典》（四部）[1]相關規定，微生物限度檢查應進行需氧菌、霉菌和酵母菌總數的測定，及金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查。為使供試品的微生物得到真實反映，必須使其在該檢驗條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長，從而保證檢驗結果的科學性和準確性[2－3]。在對膚寧洗劑進行微生物限度檢查時發現其有一定的抑菌作用，故建立膚寧洗劑的微生物限度檢查方法并對其進行驗證試驗，從而為同類藥物的微生物限度檢查提供科學的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓風干燥箱、恒溫電熱培養箱、生物安全柜、紅外滅菌器。

1.2 培養基胰酪大豆胨液體培養基（批號：151027）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號150825）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號150801）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號150806）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號150801）、pH7．0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（批號140508）。以上培養基均購買自北京路橋技術股份有限公司，并且通過2015版《中國藥典》所規定的相關適用性試驗，按使用說明書配制。

1.3 供試品膚寧洗劑（批號160222，160223，151006），杭州市第三人民醫院制劑中心。

1.4 試驗用菌株及菌液制備金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、銅綠假單胞菌【CMCC（B）10104】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】、黑曲霉菌【CMCC（F）98003】。

以上菌種均由浙江省食品藥品檢驗研究院提供，傳代次數均為第5代。

2 方法學驗證試驗

2.1 菌液制備取經33℃培養18～24h后的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培養物1個白金耳，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液；取經23℃培養48～72h后白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物1個白金耳，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液；取經23℃培養120～168h后的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，用3mL 0．9%氯化鈉溶液將孢子洗脫，再用無菌毛細吸管吸出孢子懸液至無菌試管內，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的孢子懸液。金黃色葡萄球菌菌液取10－7稀釋級，銅綠假單胞菌菌液取10－6稀釋級，枯草芽孢桿菌菌液取10－6稀釋級、白色念珠菌菌液取10－6稀釋級、黑曲霉菌菌液取10－4稀釋級。

2.2 供試液的制備量取供試品10mL，加pH7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，制成1：10的供試液。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的驗證

2.3.1 試驗組（1）平皿法：取已制備的供試液1mL，及五種試驗菌菌液，分別注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相應培養基15～20mL，每株菌平行制備2個平皿，待冷凝后，置所需溫度下倒扣培養至規定的時間，觀察計數。（2）培養基稀釋法：取已制備的供試液0．2mL及五種試驗菌菌液，其余方法同平皿法。（3）薄膜過濾法：取標號A、B、C、D、E五個錐形瓶，加0．9%無菌氯化鈉溶液50mL，將制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0．1mL分別置A、B、C、D、E五個錐形瓶中，混勻。用少量沖洗液潤濕濾膜，取供試液1mL用薄膜過濾法濾過。取總量200mL0．9%無菌氯化鈉溶液沖洗供試品，最后分別將A、B、C、D、E五個錐形瓶內的菌懸液倒入濾筒，濾過。測定需氧菌總數：轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，平行兩份，置33℃培養箱培養至規定的時間，觀察計數。測定霉菌和酵母菌總數：轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，平行兩份，置23℃培養箱培養至規定的時間，觀察計數。

2.3.2 菌液組取pH7．0氯化鈉－蛋白胨緩沖液替代供試品溶液，同試驗組操作。

2.3.3 供試品對照組取制備好的供試液1mL，不加菌液，同試驗組操作。試驗組的菌落回收率（%）=

2.4 控制菌檢查法驗證

2.4.1 試驗組（1）常規法：取已制備的供試液各10mL，分別至盛有100mL胰酪大豆胨液體培養基兩個錐形瓶中，再加入50～100cfu金黃色葡萄球菌菌及銅綠假單胞菌菌懸液各1mL，于33℃培養24h。取上述培養物分別劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養基及溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，于33℃培養24h。觀察結果。（2）薄膜過濾法：取已制備的供試液各10mL，用薄膜過濾法過濾，再用0．9%無菌氯化鈉溶液總量為200mL沖洗，將膜取出，置于100mL胰酪大豆胨液體培養基中，再加50～100cfu金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌菌懸液各1mL，其余與同常規法。

2.4.2 供試品對照組不加菌液，方法同試驗組。

2.4.3 陰性對照組以10mL稀釋液代替供試品，方法同試驗組。

3 結果

按平皿法、培養基稀釋法及薄膜過濾法三種方法測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數中的供試品對照組的菌落數，在規定條件下培養。結果三種方法中3個批次藥品的供試品對照組本底組菌落數均為零。

按平皿法、培養基稀釋法及薄膜過濾法三種方法測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數中的試驗組及菌液中的菌落數，在規定條件下培養。結果平皿法及培養基稀釋法中五種陽性菌種的回收率均低于0．5，低于2015版《中國藥典》規定的0．5～2的回收率，而薄膜過濾法的五種陽性菌種的回收率均在0．5～2的范圍內。說明該產品具有抑菌作用，可采用薄膜過濾法進行該產品的微生物限度檢查。見表1。

采用常規法及薄膜過濾法對控制菌的檢查，結果常規法中試驗組、供試品對照組及陰性對照組三批次膚寧洗劑中均未檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌；而薄膜過濾法中試驗組三批次膚寧洗劑中檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，均為（++），供試品對照組及陰性對照組三批次膚寧洗劑中均未檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌。

4 討論

膚寧洗劑含有多種中藥成分，據文獻[4－8]報道，黃柏、白鮮皮、地膚子均有不同程度的抑菌作用。其中任何一味中藥具有的抑菌作用均可能影響該制劑微生物限度檢查的準確性，但其抑菌作用對該制劑的微生物限度檢查到底有多大影響則無法確定，故采取2015年版《中國藥典》規定的三種方法對其進行驗證試驗，來確定最為合適的檢查方法。平皿法常用于無抑菌作用及抑菌作用較弱的藥物，對抑菌作用較強或強的藥物一般采用培養基稀釋法及薄膜過濾法[9－10]。為了藥品的檢出結果可靠、準確、無假陰性，應在檢驗前消除其自身的抑菌作用所造成的干擾。實驗結果表明，在需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定中，膚寧洗劑對五種陽性菌均具有不同程度的抑菌作用。采用平皿法及培養基稀釋法檢查均達不到2015年版《中國藥典》的規定，而采用薄膜過濾法則可消除膚寧洗劑的抑菌作用從而達到規定；控制菌檢查中常規法未檢測出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，而薄膜過濾法可檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，故本制劑的控制菌檢查選用薄膜過濾法。

表1 三種方法陽性菌菌落數及回收率結果（cfu/mL，）

表1 三種方法陽性菌菌落數及回收率結果（cfu/mL，）

方法平皿法組別試驗組菌液組菌種160222需氧菌霉菌和酵母菌試驗組菌液組回收率160223試驗組菌液組回收率151006培養基稀釋法試驗組菌液組回收率160222試驗組菌液組回收率160223試驗組菌液組回收率151006薄膜過濾法試驗組菌液組回收率160222試驗組菌液組回收率160223試驗組菌液組回收率151006回收率金黃色葡萄球菌21．0±11．382．5±4．90．323．5±6．489．5±9．20．316．0±7．188．0±9．90．234．5±3．588．5±4．90．432．5±3．591．0±4．20．430．5±2．185．5±12．00．482．5±6．487．0±5．70．980．0±11．381．5±3．51．081．0±11．376．5±3．51．1銅綠假單胞菌20．5±0．784．0±7．10．321．0±2．888．5±2．10．323．0±12．783．5±7．80．331．5±3．592．0±7．10．432．0±7．189．5±9．20．426．0±2．882．5±4．90．480．5±7．885．5±3．50．981．5±7．876．0±4．21．181．0±8．587．5±6．41枯草芽孢桿菌21．0±2．886．0±9．90．319．5±3．579．5±6．40．319．5±0．781．0±8．50．329．0±5．786．5±12．00．427．0±2．880．5±2．10．432．5±2．188．5±2．10．467．0±4．285．5±9．20．872．5±9．282．5±13．40．979．0±8．578．5±13．41．1白色念珠菌16．5±3．589．0±8．50．221．5±2．182．5±4．90．321．0±4．274．0±7．10．330．5±4．987．5±4．90．424．0±2．886．0±11．30．330．5±4．983．5±7．80．490．5±6．480．5±3．51．270．0±8．577．5±7．80．974．5±10．681．0±12．71黑曲霉菌9．5±0．773．5±7．80．214．0±1．472．5±6．40．212．0±4．271．5±4．90．218．0±1．475．0±4．20．322．5±2．176．0±9．90．322．5±6．477．5±4．90．361．5±7．871．0±2．80．959．5±3．571．0±11．30．961．0±5．770．0±1．40．9白色念珠菌15．0±2．875．5±9．20．220．0±1．476．0±4．20．319．0±1．479．5±6．40．327．0±4．290．0±5．70．325．5±4．991．5±6．40．332．5±4．988．5±4．90．481．5±3．584．5±6．4167．0±7．179．5±3．50．971．0±12．792．5±4．90．8黑曲霉菌11．5±2．171．0±4．20．210．5±2．165．5±3．50．212．5±2．173．0±5．70．225．5±6．480．5±2．10．425．5±2．172．5±6．40．420．5±4．971．0±5．70．366．5±4．974．5±4．90．963．0±5．758．0±4．21．158．5±4．967．0±5．70．9

通過驗證試驗得出，膚寧洗劑的微生物限度檢查方法中，需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數及控制菌檢查均宜采用薄膜過濾法。

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（收稿：2016-12-25修回：2017-01-10）

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黃巧玲，Tel：13600529925；E-mail：HQL6512@163.com