SOX4對非小細胞肺癌細胞A549的順鉑耐藥作用的影響

李維 劉旭 張國倩 張琳琳

肺癌是近年來全球范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率近年來也明顯上升[1,2]。肺癌中約85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[3]，其發病率在肺癌中居首位[4]，患者5年內生存率不足15%[5]。以順鉑（DDP）為主的聯合化療是目前治療晚期NSCLC的標準方案，但目前部分患者對順鉑耐受是導致化療失敗的主要原因[6]。因此，對順鉑耐藥的分子機制的研究對NSCLC的防治和提高療效具有深遠意義。SOX4是轉錄調控分子家族SOX重要成員，研究表明，SOX4在多種腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用,機制之一可能是其通過調控β-catenin的表達對Wnt信號通路進行調控[7]，而β-catenin在NSCLC細胞對順鉑的耐受中起著重要作用[8]。因此，本研究旨在研究SOX4對小細胞肺癌細胞A549的順鉑耐藥作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養基、小牛血清購于美國HyClone公司。順鉑（DDP）為齊魯制藥廠生產。SOX4的siRNA購自QIAGEN公司。SOX4、β-catenin和Survivin抗體購自Abcam公司。免疫印跡化學發光系統購自Syngene公司。MTT購自Sigma公司。Trizol、SYBR和Lipo2000購自美國Invitrogen公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自加拿大Fermentas公司。肺癌細胞株A549由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肺癌細胞A549培養于含10%FBS的1640培養基中，培養液含青霉素/鏈霉素100 U/mL，將細胞置于37oC、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 體外誘導法建立順鉑耐藥的肺癌細胞株A549/DDP對數生長期A549細胞在含有0.1 μM順鉑的1640培養基培養4周后，將細胞消化傳代用正常培養基培養，待細胞貼壁后，將順鉑濃度提高至0.2 μM，培養4周；再依次將藥物濃度提高到0.4 μM、0.6 μM、0.8 μM、1 μM……2 μM培養。在2 μM濃度下維持培養，初步得到A549/DDP細胞。

1.2.3 A549細胞與耐藥A549/DDP細胞細胞生長曲線測定取對數生長期的A549細胞和耐藥A549/DDP細胞，以5×103個/孔接種于24孔板中，100 μL/孔，37oC、5%CO2培養，分別于24 h、48 h、72 h、96 h和120 h胰酶消化，對細胞進行計數，每組3個復孔，每孔計數3次，取平均值繪制細胞生長曲線。

1.2.4 CCK8檢測A549及A549/DDP細胞對順鉑耐藥性 取對數生長期的A549細胞和耐藥A549/DDP細胞，以0.3×105個/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，37oC、5%CO2培養。20 h后，加入梯度濃度的順鉑處理，每組設置3個復孔，培養48 h后，將舊培養基吸去，置換含10%CCK-8的新鮮培養基，37oC、5%CO2繼續培養，3 h后，測450 nm吸光度值，計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。

1.2.5 A549/DDP細胞SOX4 siRNA轉染 取對數生長期的A549/DDP細胞，以1×106個/mL接種于六孔板中，1 mL/孔，37oC、5%CO2培養。24 h后用Lipo2000將SOX4的兩條siRNA以及siRNA con轉染A549/DDP細胞中，轉染48 h后檢測A549/DDP細胞對順鉑半數抑制濃度IC50，方法同1.2.4。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平 用Trizol法提取非小細胞肺癌細胞A549/DDP的總RNA，利用RevertAid First逆轉錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，分別以SOX4、β-catenin及Survivin實時定量PCR引物進行RT-PCR反應。SOX4引物：上游引物：5’-GGCCTG TTTCGCTGTCGGGTC-3’；下游引物：5’-GCCTGCATG CAACAGACTGGCA-3’；β-catenin引物：上游引物：5’-T GGTGCCCAGGGAGAACCC-3’；下游引物；5’-GTCAG CACCAGGGTGGTGGCA-3’；Survivin引物：上游引物：5’-TGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCA-3’；下游引物：5’-AAAGGAAAGCGCAACCGGACGAAT-3’；內參GAPDH引物：上游引物：5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’；下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 水平收集細胞，用細胞裂解液RIPA裂解提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒流300 mA轉移至PVDF印跡膜。5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗，4oC孵育過夜。次日PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h。用化學發光法顯色，凝膠成像系統采集成像。

1.3 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，結果用Mean±SD描述，組間比較應用t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 A549及A549/DDP細胞對順鉑耐藥性 本研究檢測了A549/DDP細胞及其親本細胞A549對順鉑的半數抑制濃度IC50，結果如圖1所示，A549/DDP細胞對順鉑耐藥性顯著增強，A549/DDP和A549細胞的IC50分別為（27.87±0.92）μM和（2.04±0.37）μM，兩者具有顯著差異（P＜0.001）。耐藥細胞株對順鉑耐藥性增加了13.7倍。

2.2 A549細胞與耐藥A549/DDP細胞生長曲線比較 為驗證構建順鉑耐藥細胞株對A549細胞增殖的影響，本研究首先檢測了A549細胞與耐藥細胞株A549/DDP的生長曲線，如圖2顯示，耐藥A549/DDP細胞增值速度與其親本細胞A549增殖速度幾乎相同，曲線無顯著差異（P＞0.05），說明構建耐藥順鉑細胞株后未影響細胞的增殖能力。

2.3 A549和A549/DDP細胞中SOX4的表達 為驗證SOX4與NSCLC細胞A549順鉑耐藥的關系，本研究檢測了耐藥細胞株中SOX4蛋白的表達，結果如圖3顯示，構建的耐藥細胞株A549/DDP中SOX4的表達明顯上調（P＜0.001），提示SOX4可能在NSCLC細胞耐藥過程中發揮作用。

2.4 敲減A549/DDP細胞中SOX4的表達對細胞耐藥性的影響 為驗證SOX4對NSCLC細胞A549順鉑耐藥的影響，本研究在敲減SOX4后用CCK8法檢測了A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。結果如圖4顯示，與轉染對照siRNA con細胞比，siRNA轉染在轉錄水平和蛋白表達水平均顯著抑制了SOX4的表達（P＜0.001），而A549中SOX4的表達也較A549/DDP顯著降低（P＜0.01）。通過細胞對于順鉑耐藥性結果顯示，敲減SOX4后，細胞對順鉑耐藥性顯著降低（P＜0.001），且在SOX4低表達的A549中，對于順鉑的耐藥性同敲減了SOX4后耐藥性相似。A549、A549/DDP、siRNA con、siRNA-1、siRNA-2的IC50分別為（1.98±0.24）、（28.17±4.36）、（26.57±6.21）、（0.87±0.28）、（0.92±0.57）。

2.5 敲減SOX4對Wnt信號通路相關蛋白表達的影響 為探索SOX4對NSCLC細胞對順鉑耐藥性的分子機制，本研究檢測了敲減SOX4后Wnt信號通路關鍵蛋白β-catenin及其下游靶基因Survivin的mRNA和蛋白表達情況，結果如圖5所示，敲減SOX4后，A549/DDP細胞內β-catenin及Survivin的mRNA水平顯著降低（P＜0.01），同時Western blot結果顯示兩種蛋白的表達顯著降低。該結果顯示SOX4影響了β-catenin與Survivin蛋白的表達，可能與細胞對于順鉑耐藥性改變的因素。

3 討論

圖 1 A549細胞與A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性Fig 1 The resistance of A549 cells and A549/DDP cells to cisplatin

圖 2 A549細胞與A549／DDP的細胞生長曲線Fig 2 Cell growth curve of A549 cells and A549 / DDP

圖 3 SOX4在A549與A549/DDP細胞中的表達Fig 3 Expression of SOX4 in A549 and A549/DDP cells

圖 4 敲減SOX4后A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。A：敲減SOX4后，實時定量PCR檢測SOX4 mRNA表達水平；B：敲減SOX4后，Western bot檢測蛋白表達水平；C：檢測A549及不同敲減SOX4的A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。Fig 4 Resistance of A549/DDP cells to cisplatin after knockdown of SOX4. A: Expression level of SOX4 mRNA of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by real-time quantitative PCR; B: The expression level of SOX4 of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by Western blot; C:Resistance of A549 and A549/DDP cells to cisplatin.

圖 5 敲減SOX4后對β-catenin和Survivin表達的影響。A：敲減SOX4后，實時定量PCR檢測β-catenin和Survivin mRNA表達水平；B：敲減SOX4后，Western blot檢測β-catenin和Survivin蛋白表達。Fig 4 Expression of β-catenin and Survivin of A549/DDP after knockdown of SOX4. A: Expression level of β-catenin mRNA and Survivin mRNA of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by real-time quantitative PCR; B: Expression of β-catenin and Survivin of A549/DDP after knockdown of SOX4 was detected by Western blot.

肺癌是目前全球范圍內惡性腫瘤之一，NSCLC是最常見的肺癌類型，也是肺癌治療的重點[9]，化療是重要的臨床治療手段，以順鉑（DDP）為主的聯合化療也是目前治療晚期NSCLC的標準方案，對順鉑耐受是導致化療失敗的主要原因。因此，本研究首先構建了順鉑耐藥細胞株A549/DDP作為研究模型，探究NSCLC對順鉑的耐藥機制。

研究[10,11]表明，SOX4在多種癌癥中均有異常表達，其表達的增加可作為乳腺癌和NSCLC患者不良預后的生物標志物，并在一定程度上影響了相關腫瘤細胞對藥物的敏感性。但SOX4與NSCLC對順鉑耐藥性的影響目前無相關報道。本研究發現，順鉑耐藥細胞株A549/DDP中SOX4蛋白的表達水平顯著高于其親本A549細胞，并且siRNA敲減SOX4的表達后，A549/DDP細胞的耐藥性顯著降低，說明SOX4對NSCLC細胞對順鉑的耐藥性有重要的調控作用，提示SOX4可作為增加NSCLC順鉑敏感性的重要靶點。

WNT/β-catenin信號通路在腫瘤發生發展過程中有重要的調控作用，Wnt信號通路的異常與多種腫瘤化療耐受密切相關[12,13]。研究表明，SOX4能夠通過Wnt/β-catenin信號通路影響黑色素瘤細胞的增殖[14]，并且，Wnt信號通路下游靶分子Survivin與腫瘤抗藥相關，其siRNA可能作為克服腫瘤抗藥的新型治療手段[15]。本研究發現，在耐藥細胞株中干擾SOX4的表達后，Wnt信號通路關鍵蛋白β-catenin及其下游靶分子Survivin的蛋白表達水平顯著降低。由此推測，SOX4可能通過Wnt信號通路中β-catenin的表達進而調節其下游靶分子Survivin從而介導A549/DDP細胞對順鉑耐藥。

綜上所述，本研究利用順鉑誘導構建耐藥細胞株A549/DDP，發現其SOX4的蛋白表達水平顯著高于親本細胞，進一步研究表明，敲減SOX4后，A549/DDP細胞耐藥性顯著降低，且Wnt信號通路關鍵蛋白β-catenin及其下游靶分子Survivin的蛋白表達水平顯著降低，推測SOX4可能通過調節Wnt信號通路影響NSCLC的敏感性，具體分子機制還有待進一步研究，能否將SOX4作為克服NSCLC耐藥的新靶點也有待進一步的探索。