EGFR突變的肺腺癌患者中Rb和磷酸化Rb的表達(dá)及臨床特征分析

董云龍 劉明輝 李永文 李穎 趙辰龍 袁茵 杜暉 張子禾 張洪兵 劉紅雨 陳軍

肺癌已經(jīng)躍居腫瘤發(fā)病率之首，成為癌癥死亡的主要原因。肺癌發(fā)病的根本原因，在于體內(nèi)原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，致使細(xì)胞惡性增殖及不可逆轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[1-4]。RB基因（視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因）是人體內(nèi)重要的抑癌基因，通過(guò)控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖。Rb-E2F信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞周期G1后期通過(guò)限速點(diǎn)R到S期的關(guān)鍵信號(hào)分子和通路，通常情況下，Rb與E2F1結(jié)合，使E2F1沒(méi)有活性，但在腫瘤中經(jīng)常由于突變、雜合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）、甲基化或磷酸化等原因使Rb失活，使之釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，E2F1可促進(jìn)cyclin E、cyclin A等能控制細(xì)胞分裂的基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期進(jìn)展，細(xì)胞增殖[5-11]。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，在肺癌中普遍存在Rb蛋白的表達(dá)異常。比如，有研究顯示非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中約20%-40%存在Rb蛋白表達(dá)降低。另有研究提示，NSCLC中約12.5%的患者存在Rb的表達(dá)降低，在不同的肺癌類(lèi)型中，表達(dá)情況不同，其中鱗癌中約有5.5%，肺腺癌中有19.4%。其他研究顯示在大細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌的突變率較高，約68%和87%[12-14]。因此Rb的異常普遍存在于肺癌中，是肺癌重要的發(fā)病因素。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因作為肺腺癌重要的驅(qū)動(dòng)基因（diver gene），在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。EGFR信號(hào)通路一旦被激活，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活化和受體自身磷酸化，從而促使細(xì)胞增生、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成及凋亡抑制。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKI）通過(guò)阻斷細(xì)胞受體的三磷酸腺苷結(jié)合位點(diǎn)，阻止下游信號(hào)傳遞而產(chǎn)生腫瘤抑制作用。在具有EGFR突變的NSCLC患者中，使用EGFR-TKI療效優(yōu)于傳統(tǒng)的化療，且毒副作用小，患者耐受性好。EGFR外顯子19或/和21的突變異常將導(dǎo)致EGFR結(jié)合ATP的能力增加，從而加強(qiáng)了TKI的療效因此，具有EGFR突變的NSCLC患者是EGFRTKI治療的優(yōu)勢(shì)人群，而女性、非吸煙的腺癌患者，其EGFR突變發(fā)生頻率更高，成為EGFR-TKI治療的優(yōu)勢(shì)人群[15-20]。

在EGFR突變的肺腺癌患者中Rb及磷酸化Rb的表達(dá)情況未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將利用免疫組化技術(shù)，分析23例具有EGFR突變的肺腺癌患者腫瘤組織中Rb及磷酸化pRb-780、pRb-795的表達(dá)情況，分析在具有EGFR突變的患者中Rb的異常表達(dá)與患者臨床病理生理特征的關(guān)系以及與患者預(yù)后的關(guān)系，探討EGFR信號(hào)通路與Rb信號(hào)通路是否具有協(xié)同性。

1 材料與方法

1.1 患者的基本信息以及臨床資料 23例EGFR突變的肺腺癌患者標(biāo)本取自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科2014年1月-2015年12月手術(shù)患者，術(shù)后病理診斷為肺腺癌。術(shù)前未接受放療、化療及分子靶向治療。EGFR突變檢測(cè)分別由廣州益善公司和廣州燃石公司完成。表1列出了23例患者的詳細(xì)臨床信息。共有14例男性，9例女性，年齡26歲-71歲，中位年齡62歲，吸煙者11例，不吸煙12例，臨床I期/II期10例，III期/ IV期13例；EGFR 19外顯子突變患者11例，21外顯子突變9例，20外顯子突變2例，其他位點(diǎn)突變有1例（表1）。

1.2 免疫組化 23例組織標(biāo)本均由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科常規(guī)固定、包埋，切片。4 μm-6 μm厚的常規(guī)病理石蠟切片，70 °C烤片40 min，脫蠟，脫水后，經(jīng)Tris/EDTA修復(fù)液（pH8.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，正常羊血清RT封閉30 min，加入一抗4 °C過(guò)夜，經(jīng)生物素化的二抗37 °C 30 min，辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37 °C 30 min，DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染。抗體稀釋倍數(shù)為1:20-1:100。Rb、pRb-780、pRb-795兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

Rb、pRb-780、pRb-795陽(yáng)性染色呈棕黃色或者黃褐色顆粒，三種蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，由于Rb基因的雜合缺失可以導(dǎo)致正常Rb蛋白表達(dá)缺失或者表達(dá)一種不完全的Rb蛋白，這一部分的Rb蛋白不進(jìn)入細(xì)胞核，所以可能導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的輕度著色，所以在免疫組化染色中會(huì)出現(xiàn)一部分在細(xì)胞質(zhì)染色的病例，我們將其劃歸為非特異染色[12,21]。Rb的結(jié)果判定：根據(jù)在400×高倍鏡下比較23例肺癌組織標(biāo)本和同一例患者癌旁肺組織的陽(yáng)性染色程度，對(duì)陽(yáng)性染色的癌組織以及癌旁肺組織的陽(yáng)性染色進(jìn)行評(píng)分，若肺癌組織中染色強(qiáng)度比癌旁肺組織強(qiáng)或者相同，則判斷為無(wú)表達(dá)降低/缺失，若癌組織染色比癌旁肺組織染色弱或無(wú)，即判定為Rb蛋白表達(dá)降低或缺失。pRb的判定：根據(jù)400×高倍鏡下，若肺癌組織中陽(yáng)性染色強(qiáng)度比癌旁肺組織高，則判斷為Rb過(guò)度磷酸化，若癌組織染色與癌旁肺組織染色相同或弱，即判定無(wú)Rb過(guò)度磷酸化。切片不加入一抗，作為空白對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用卡方檢驗(yàn)及非參數(shù)檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rb及pRb-780、pRb-795在EGFR突變肺腺癌患者中的表達(dá)情況 Rb蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，一部分病例陽(yáng)性染色細(xì)胞排列呈巢狀，周?chē)唤Y(jié)蹄組織分割，另可見(jiàn)部分患者的細(xì)胞排列成腺腔樣（圖1）。在23例肺腺癌患者中，16例（16/23, 69.6%）存在表達(dá)降低/缺失。Rb的表達(dá)情況與患者臨床病理生理特征分析后發(fā)現(xiàn)，在不同年齡、性別、吸煙史、臨床分期、腫瘤位置及不同的EGFR突變位點(diǎn)的患者中未見(jiàn)顯著性差異。

表 1 患者的統(tǒng)計(jì)資料Tab 1 Patient demographics

圖 1 Rb（A、B）及pRb-780（C、D）、pRb-795（E、F）免疫組化結(jié)果示意圖。Rb在肺腺癌組織細(xì)胞（B）中較癌旁肺組織（A）中表達(dá)減低；pRb-780和pRb-795在肺腺癌組織（D、F）中比癌旁肺組織（C、E）中過(guò)表達(dá)。Fig 1 Representative Rb (A, B), pRb-780 (C, D), pRb-795 (E, F) immunostaining results. Reduced expression of Rb in adenocarcinoma cells were detected (B) compared to adjacent lung tissue cells (A). pRb-780 and pRb-795 were overexpressed in adenocarcinoma (D, F) compared to adjacent lung tissue cells (C, E).

表 2 23例肺癌患者中Rb and p-Rb的表達(dá)情況以及臨床信息Tab 2 The expression of Rb and p-Rb in 23 lung cancer patients by immunohistochemical staining and their clinical characteristics

表 3 23例肺癌患者的生存時(shí)間Tab 3 The survival time of 23 lung cancer patients

pRb-780表達(dá)與Rb類(lèi)似，表達(dá)于細(xì)胞核中，大部分陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞排列成腺腔樣；可見(jiàn)部分排列成巢狀，呈鱗狀分化，周?chē)杀焕w維組織分隔；少數(shù)的病例陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞散在分布。在同一病例中可見(jiàn)不規(guī)則分布的從低到高度的表達(dá)差異。23例患者中有17例患者存在pRb-780染色增強(qiáng)，即pRb-780過(guò)表達(dá)，占73.9%。分析患者例臨床信息與pRb-780蛋白表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，III期/IV期患者中與I期/II期患者相比，pRb-780蛋白過(guò)表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）；未發(fā)現(xiàn)與年齡、性別、吸煙史、腫瘤位置等臨床信息相關(guān)。

pRb-795同樣主要在細(xì)胞核中表達(dá)，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞排列成巢狀、腺腔樣、偶爾可見(jiàn)呈乳頭狀排列。16例（16/23, 69.6%）患者存在pRb-795的過(guò)表達(dá)。通過(guò)分析pRb-795蛋白的表達(dá)情況與患者臨床病理生理特征發(fā)現(xiàn)：與I期/II期患者相比，III期/IV期有更多的患者存在pRb-795的過(guò)表達(dá)，但是差異不顯著（P=0.074）；其他未見(jiàn)明顯差異（表2）。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，23例患者均存在Rb表達(dá)降低和/或pRb增加。

2.2 Rb、pRb-780、pRb-795表達(dá)情況與EGFR突變肺腺癌患者的預(yù)后分析 在23例患者中，有20例具有完整的隨訪信息，其中，死亡3例，至今生存17例。我們進(jìn)一步依據(jù)其Rb、pRb-780、pRb-795的表達(dá)情況進(jìn)行了生存期的初步分析。在Rb表達(dá)無(wú)降低和表達(dá)降低的患者，生存時(shí)間分別為26個(gè)月和24.8個(gè)月；pRb-780表達(dá)增強(qiáng)和無(wú)增強(qiáng)的患者，生存時(shí)間分別為24.8個(gè)月和26.1個(gè)月，pRb-795表達(dá)增強(qiáng)和無(wú)增強(qiáng)的患者，生存時(shí)間分別為24.8個(gè)月和26.5個(gè)月；存在Rb表達(dá)異常的患者以及P-Rb過(guò)表達(dá)的患者生存時(shí)間短，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)未見(jiàn)差異（表3）。

3 討論

Rb屬于 “袋蛋白”（Pocket Protein）家族，在細(xì)胞周期的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用[22]。各種原因?qū)е碌腞b異常及功能缺失均可導(dǎo)致細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖異常。而LOH導(dǎo)致的Rb表達(dá)降低以及各種原因?qū)е碌腞b過(guò)度磷酸化是Rb失活的重要機(jī)制[23]。如Witkiewicz報(bào)道[24]稱(chēng)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，Rb的失活是由許多相互協(xié)調(diào)的機(jī)制導(dǎo)致的，約50%的乳腺癌病人中可見(jiàn)cyclin D1的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致了Rb的磷酸化而失去功能；20-30%的乳腺癌患者中可見(jiàn)Rb基因的丟失；還有部分患者是由于P16的失活導(dǎo)致了Rb的磷酸化失活。為了探討在具有EGFR突變的患者中Rb的存在狀態(tài)，我們選用23例有EGFR突變的肺腺癌標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化分別檢測(cè)了Rb、pRb-780和pRb-795位點(diǎn)的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Rb的異常表達(dá)普遍存在于EGFR突變的肺腺癌患者中：約70%的患者存在Rb的表達(dá)降低/缺失，約70%的患者存在Rb的過(guò)度磷酸化，而100%的患者存在Rb的低表達(dá)或過(guò)度磷酸化，提示在EGFR突變的肺腺癌患者中，普遍存在Rb異常所導(dǎo)致的細(xì)胞周期異常。細(xì)胞周期異常是EGFR突變肺腺癌患者重要的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步可在細(xì)胞和動(dòng)物模型水平探討使用細(xì)胞周期抑制劑是否能有效抑制EGFR突變細(xì)胞的惡性增殖，將會(huì)是一個(gè)有益的嘗試。

以往文獻(xiàn)報(bào)道在NSCLC中，采用免疫組化方法檢測(cè)到的Rb表達(dá)減弱或缺失的百分率為20%-40%左右，也有作者報(bào)道，在肺腺癌中，Rb表達(dá)減弱或缺失的頻率高于鱗癌，而我們檢測(cè)到在具有EGFR突變的肺腺癌患者中，Rb表達(dá)減弱或缺失的百分率為70%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的NSCLC患者中的百分率，是否提示在具有EGFR突變的肺腺癌中Rb的表達(dá)缺失/降低頻率高于其他病例。由于本研究只采用了免疫組化的方法檢測(cè)，需要進(jìn)一步采取手段檢測(cè)是否存在LOH、甲基化、突變等導(dǎo)致Rb表達(dá)減弱或缺失的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中23例EGFR突變的肺腺癌患者中Rb蛋白缺失或減弱以及Rb的過(guò)度磷酸化與患者的生存時(shí)間沒(méi)有顯著性差異，但是能看出，存在Rb蛋白缺失或減弱的以及存在Rb的高度磷酸化的患者生存時(shí)間偏短，推測(cè)是由于病例數(shù)偏少與隨訪時(shí)間不夠造成的。