三子養親湯對哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3影響的實驗研究?

張博達，徐 升，李俊玲，董 滟

(1. 成都中醫藥大學，成都 610075； 2. 川北醫學院附屬醫院，南充 637000； 3. 成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610073)

【實驗研究】

三子養親湯對哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3影響的實驗研究?

張博達1,2，徐 升1，李俊玲1，董 滟3△

(1. 成都中醫藥大學，成都 610075； 2. 川北醫學院附屬醫院，南充 637000； 3. 成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610073)

目的：觀察三子養親湯對哮喘模型小鼠嗜酸性粒細胞活化趨化因子- 1(Eotaxin- 1，EOT- 1)、嗜酸性粒細胞活化趨化因子- 3(Eotaxin- 3，EOT- 3)的影響，探索三子養親湯作用的分子機制。方法：按隨機數字表法將小鼠分為三子養親湯高、中、低劑量組及孟魯司特組，模型組和空白對照組建立哮喘小鼠模型，測定其肺組織中EOT- 1、 EOT- 3蛋白與基因表達。結果：與模型組比較，孟魯司特組、三子養親湯高劑量組肺組織中EOT- 1、EOT- 3濃度明顯降低，差異有統計學意義；三子養親湯中劑量組肺組織中EOT- 1、EOT- 3濃度降低，差異有統計學意義。結論：三子養親湯能改善哮喘小鼠癥狀，其機制可能與下調EOT- 1和EOT- 3的表達有關。

支氣管哮喘；三子養親湯；氣道炎癥；平滑肌細胞；嗜酸性粒細胞趨化因子

支氣管哮喘是由多種細胞 (如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。前期實驗研究證實，三子養親湯能抑制哮喘炎癥狀態，而嗜酸性粒細胞在肺部組織的募集、活化趨化因子方面發揮了重要作用[1]。因此，本實驗從EOT- 1、EOT- 3入手，探索三子養親湯改善哮喘炎癥狀態的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇鼠齡4～8周的C57BL小鼠共65只，平均體質量(18～22)g。小鼠購于成都達碩動物實驗有限公司(合格證號SCXK(川)2008- 24)，所有實驗小鼠均喂飼于成都中醫藥大學動物實驗中心。飼養條件要求：所有小鼠以標準的實驗鼠飼料喂養，12 h持續燈光照射，室溫維持在25 ℃左右，相對濕度維持于50%～70%。所有小鼠能自行進食、飲水，在上述條件適應性喂養1周后正式開始實驗。

1.2 藥品與試劑

“三子養親湯”湯劑由萊菔子12 g、白芥子12 g、紫蘇子12 g組成，試驗藥物購自四川中藥材公司，由成都中醫藥大學藥學院藥劑科統一煎煮、濃縮；孟魯司特片10 mg，杭州默沙東制藥有限公司；OVA，sigma公司；Mouse Eotaxin1 ELISA kitIB- 22899試劑盒、 Mouse Eotaxin3 ELISA kitIB- 22897試劑盒、上海江萊生物科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒，武漢博士德生物技術公司。

1.3 主要實驗儀器

倒置生物顯微鏡CKX- 31，日本奧林巴斯公司；超臨界萃取儀，SFT- 1000美國SFT公司；酶標儀，Multlskan Mk3賽默飛世爾儀器有限公司；小鼠肺功能儀 EMKA，France。

1.4 動物分組及造模

60只SPF級C57BL小鼠按隨機數字表法分為空白組5只、孟魯司特組5只、哮喘模型組20只和三子養親湯高、中、低組各10只。哮喘小鼠模型采用腹腔注射卵蛋白加霧化激發復制，分別于第1天和第14天于腹腔內注射0．1%卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混合液(二者比例為1∶4，pH7.4)。15～28 d在自制玻璃箱中霧化吸入2%卵蛋白生理鹽水5 ml，每日1次，每次持續30 min，連續激發14 d。空白組以相同方法霧化吸入0.9%生理鹽水5 ml。

1.5 給藥

灌胃和激發階段同步進行。在每天激發前1 h，對中藥組小鼠分別給予濃度10.8 g·kg-1·d-1、5.4 g·kg-1·d-1、2.7 g·kg-1·d-1的三子養親湯中藥湯劑1 ml灌胃。西藥組小鼠用孟魯司特0.004 g·kg-1·d-1藥量1 ml進行灌胃，空白組使用生理鹽水灌胃，連續灌胃2周。

1.6 小鼠肺功能測試

末次激發后進行小鼠無創肺功能測試，將小鼠置于EMKA肺功能霧化器中，按0 mg/ml、3.125 mg/ml、6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml由低到高霧化乙酰膽堿，并記錄Penh值5 min。

1.7 肺組織中EOT- 1、 EOT- 3含量檢測

用頸部脫臼法處死小鼠，剪開胸腔將實驗小鼠左肺小心剝離，取5 g肺組織在無菌條件下勻漿，取勻漿細胞上清液。根據試劑盒測試要求處理受試樣品，應用酶聯免疫吸附法按試劑說明檢測哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3的含量。

1.8 形態學觀察

小鼠處死后，肺組織標本以10%福爾馬林固定，以蘇木精- 伊紅(H&E) 染色，并作病理切片，觀察肺組織的形態變化。

1.9 EOT- 1、 EOT- 3 mRNA q- PCR 檢測

小鼠肺組織用Trizol試劑提取總RNA，并檢測其純度及完整性制備cDNA。將引物離心，用去離子水稀釋后與cDNA反應，經40個循環后所得結果用ΔΔCT法分析。

引物序列：從美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中搜索基因序列，使用Primer Premier 引物設計軟件篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以ULTRAPAGE純化。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

1．10 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠肺功能結果

表2顯示，各組小鼠肺功能Penh值與乙酰膽堿濃度呈正相關，濃度低于12.5 mg/ml時，各組肺功能與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)；濃度高于12.5 mg/ml時，各組肺功能與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 小鼠肺功能結果

注：與空白組比較：#P<0.05

2.2 肺組織病理學觀察

光鏡下可見，空白組肺組織結構完整，模型組及各治療組均可見不同程度的炎性細胞浸潤、肺大皰形成、上皮水腫以及部分痰栓形成。正常組肺泡結構正常，肺組織形態無異常(見圖A)；模型組支氣管黏膜出現大量炎性細胞聚集、大量杯狀細胞，肺泡腔擴大(見圖B)；三子養親湯高劑量組肺泡腔內偶見炎細胞散落，上皮水腫明顯減輕，氣管管壁無顯著增厚(見圖C)；三子養親湯中劑量組內聚集少量炎細胞，氣管管壁輕微增厚(見圖D)；三子養親湯低劑量組炎性浸潤與上皮水腫輕微緩解，氣管管壁有所增厚(見圖E)；孟魯司特組支氣管腺體可見增生，少量杯狀細胞聚集于氣道內，少量黏液栓塞于小氣道內(見圖F)。

2.3 肺組織中EOT- 1、 EOT- 3蛋白與基因的含量測定結果

表3顯示，與空白對照組比較，各組EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因表達均增加(P<0.05)；與哮喘模型組比較，用藥組中除三子養親湯低劑量組外，哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因表達均降低(P<0.05)，提示三子養親湯高中劑量及孟魯司特能降低EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因的表達；與孟魯司特組比較，除三子養親湯低劑量組外，哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3含量比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示三子養親湯中高劑量組對EOT- 1、EOT- 3的抑制與孟魯司特組相當。

表3 三子養親湯對哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因的影響

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組小鼠肺組織病理切片觀察(HE×100)注： A.正常組；B.模型組； C.三子養親湯高劑量組； D.三子養親湯中劑量組；E.三子養親湯低劑量組；F.孟魯司特組

3 討論

哮喘是與激活的肥大細胞密切相關的炎癥反應性疾病。肥大細胞可被特異性抗原激活，通過IgE途徑釋放組胺及引起白三烯的合成，這些介質可以增加氣道平滑肌張力引起氣流阻塞。小鼠肺功能中乙酰膽堿濃度>12.5 mg/ml時，模型組Penh值對比空白組有統計學意義，支氣管激發試驗陽性，確定其為哮喘造模成功。

嗜酸性粒細胞是哮喘中重要的炎癥細胞，EOT因其在體內外試驗中發現對嗜酸性粒細胞有很強的選擇趨化性而得名。研究發現，抗原誘導嗜酸性粒細胞在肺部組織的募集中eotaxin起主要作用。嗜酸性粒細胞被活化后可以分泌大量包含在嗜酸性顆粒內的活性物質，引起氣道上皮細胞損傷，并導致氣道高反應性(AHR)、慢性氣道阻塞及氣道炎癥等臨床癥狀。

EOT可分為3類，即EOT- 1、EOT- 2、EOT- 3，分別被稱為CCL11、CCL24、CCL26[2]。Berkman等闡明，哮喘對象的氣道受到變態反應激發后Eot- 3mRNA的表達不斷增加，但未見Eot- 1，提示Eot- 3在遲發的哮喘反應中起重要作用。EOT除在嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和內皮細胞有明確的表達外[3]，還能在多種器官、組織和細胞中表達。多項研究發現，人支氣管平滑肌細胞經過IL- 1β、IL- 9、IL- 13、IL- 4的刺激能表達Eot。其中IL- 9能誘導Eot- 1的表達，而IL- 4和IL- 13能誘導支氣管平滑肌細胞表達Eot- 3，故支氣管平滑肌細胞被認為是哮喘時導致嗜酸性粒細胞聚集Eot的重要來源細胞[4]。

三子養親湯出自明·《韓氏醫通》，具有降氣消食、溫化痰飲之功，為臨床治療哮喘的常用效方，方由紫蘇子、白芥子、萊菔子3味藥組成。蘇子降氣行痰、止咳平喘，白芥子溫肺利氣、快膈消痰，萊菔子消食導滯、行氣祛痰，三者合用可使氣順痰消、食積得化、咳喘得平，用于咳嗽喘逆、痰多胸痞、食少難消、舌苔白膩、脈細滑等癥[5]。“三子”均系行氣消痰之品，以消為補，合而為用，可使氣順喘停、喘咳自愈。本研究通過比較各組病理改變發現，三子養親湯具有減輕肺組織局部炎癥水腫、減少黏液分泌作用。通過觀察EOT- 1和EOT- 3、EOT- 1 mRNA、EOT- 3mRNA等指標發現，三子養親湯能減少炎癥因子釋放，降低炎癥反應發生，從而舒張支氣管緩解哮喘癥狀，其機制可能是通過下調EOT- 1mRNA、EOT- 3 mRNA的表達，降低肺組織中EOT- 1和EOT- 3的含量而發揮作用。

[1] WENZEL SE，TRUDEAU JB，BARNES S，et al. TGF- R and IL- 13 synergistically increase EOT- 1 production in human airway fibroblasts[J]. The Journal of Immunology，2002，169(8)：4613- 4619.

[2] KITAURAM，SUZUKIN，IMAIT，et al. Molecular cloning of a novel human CC chemokine(EOT- 3)that is a functional lig- and ofCC chemodine receptor3[J].J BiolChem，1999， 274(39)：27975- 27980.

[3] BEIIANAN N，OHNONA S，CHUNG FK，et al. EOT- 3 but not eotaxin gene expression is upregulated in asdnnatics 24 hours after allergen challenge[J]. Am J Respir CellMol Biol， 2001，24：682- 687.

[4] ZUYDERDUYNS，HIEMSTRAPS，BABEKF，et al. TGF- beta differentially regulates TH2 cytokine- induced eotaxin and EOT- 3 release by human airway snooth muscle cells[J]. JAllergy C linImmunol， 2004，114(4)： 791- 798.

[5] 熊成熙，鄭德明.試述三子養親湯的構理與運用[J].安徽中醫臨床雜志，2003，15 (6)：537.

Experimental Study on the Effects of Sanzi Yangqin Decoction on EOT-1 and EOT-3 in Asthmatic Micee

ZHANG Bo- da1,2, XU Shen1, LI Jun- ling1, DONG Yan3△

(1. Chengdu University of TCM,Chengdu 610075, China; 2. North Sichuan Medical College,Nanchong 637000, China;3.Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610073, China)

Objective：Research on the mechanism of Sanzi Yangqin Decoction controlling asthma. Method：Take sixty- five 4- 8 week old C57BL mice，randomly divided into the normal group and the experimental group. The mice model of chronic asthma was established through OVA sensitization. Then gavaged various doses of Sanzi Yangqin decoction or Montelukast. Deteating the EOT- 1 and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate. Results： Compared with the model group，the Eotaxin1 level in the cell supernatant of mice in the Montelukast group and SZ- H group is obviously reduced，Eotaxin3 level in the cell supernatant of mice in the SZ- L group is free from noted change，having no statistical significance. Conclusion： Sanzi Yangqin Decoction could reduce the EOT- 1and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate of mice with asthma.

Asthma; Sanzi yangqin decoction; Airway inflammation; Smooth muscle cells; Eotaxin

四川省科技廳科技攻關計劃(2014SZ- 0071)-三子養親湯通過抑制 CysLTs通路改善哮喘癥狀的機制研究

張博達(1982- )，男，四川南充人，講師，醫學博士，從事呼吸系統疾病的臨床與基礎研究。

△通訊作者：董 滟(1963- )，女，主任醫師，博士研究生導師，從事中醫內科學呼吸系統的臨床與研究，E-mail:27517113@qq.com。

R285.5

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1006- 3250(2017)07- 0934- 03

2017- 01- 10