金番止瀉膠囊對脾虛小鼠腸道菌群的影響及體外抗菌作用?

劉佩沂，賴岳曉，田素英

(1. 中山市黃圃人民醫院，廣東 中山 528429； 2. ．廣東藥科大學，廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣州 510006)

【實驗研究】

金番止瀉膠囊對脾虛小鼠腸道菌群的影響及體外抗菌作用?

劉佩沂1，賴岳曉1，田素英2,3△

(1. 中山市黃圃人民醫院，廣東 中山 528429； 2. ．廣東藥科大學，廣州 510006； 3.廣東省化妝品工程技術研究中心，廣州 510006)

目的: 探討金番止瀉膠囊對脾虛小鼠腸道菌群的調節作用及體外抗菌作用。方法: 利用番瀉葉灌胃加饑飽失常復制小鼠脾虛模型，經金番止瀉膠囊治療后，以菌落計數法檢測其盲腸內容物中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及腸桿菌的數量；采用紙片擴散法、試管2倍稀釋法考察金番止瀉膠囊對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌的抑菌作用。結果： 與正常組比較，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌及腸桿菌數量均升高，金番止瀉膠囊高(1.2 g·kg-1)、低劑量組(0.6 g·kg-1)指標均有一定的恢復并接近正常水平。對枯草桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌的MIC(mg·mL-1)分別為12.8、8.51、6.4、7.6、8.27。結論: 金番止瀉膠囊對脾虛小鼠腸道菌群有調節作用，在體外有抑菌作用。

金番止瀉膠囊；脾虛；腸道菌群；體外抗菌

金番止瀉膠囊選用我國資源豐富的番石榴葉、金櫻根等為原料，金櫻根[1-2]、番石榴葉[3]有很好的抗菌調節菌群的作用。金番止瀉膠囊是分別用水、乙醇提取各藥有效部位，按前期實驗的最佳比例制成。方中藥味數較少，制備工藝簡單，原料成本較低，藥效顯著。

1 材料

KM小鼠由廣東藥科大學實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK (粵) 2012- 0125)，飼養于溫度(20±2)℃、濕度(60%±10%)的環境下。伊紅美藍培養基(EMB)、腸球菌培養基(EC)、雙歧桿菌培養基(改良MRS)、乳酸桿菌培養基(MC) 由實驗室自制。自制金番止瀉膠囊，番瀉葉(購于廣東康圣藥業，批號20150710)按常規方法煎成生藥濃度為1 g·mL-1的水煎液。麗珠腸樂(麗珠集團麗珠制藥廠，0.5億活菌/20粒，批號 20150715)、黃連小檗堿片(青島黃海制藥有限責任公司，國藥準字H37021111)。

2 方法

2.1 對脾虛小鼠腸道菌群的調節作用

表1顯示， 健康小鼠60只雌雄各半。除正常組外，其余50只小鼠ig番瀉葉水煎液(15 mg·g-1)，并隔天禁食。連續造模8 d后，小鼠出現成群蜷縮、拱背，攝食減少，糞便松軟膨大、不成形甚至便溏，部分出現脫肛、毛色晦暗、體質量下降等脾虛癥狀，提示造模成功。挑選造模成功的小鼠將其分為模型組、金番止瀉膠囊低劑量組(0.6 g·kg-1)、高劑量組(1.2 g·kg-1)、麗珠腸樂陽性組(0.3 g·kg-1)，正常組及模型組給予等量蒸餾水，連續10 d，觀察并記錄小鼠狀況。無菌狀態下取盲腸內容物0.1 g置于EP管中，加入0.9 mL無菌生理鹽水，經震蕩器均質所得標本液按稀釋度為10-1，依此操作稀釋標本至10-6，采用涂布法定量接種0.1 mL細菌混懸液，腸桿菌、腸球菌需氧培養24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌厭氧培養48 h。根據各菌落在培養基上的菌落特征及革蘭染色進行初步鑒定，結果以菌落形成單位/g(CFU·g-1) 的對數表示。

表1 小鼠糞便中腸道菌群檢測結果

注：與模型組比較:*P<0.05;與正常對照組比較:#P<0.05。

3 結果

3.1 金番止瀉膠囊對脾虛小鼠腸道菌群的調節作用

表1顯示，給予脾虛模型小鼠金番止瀉膠囊后實驗所選4種主要腸道菌群基本恢復到正常水平。與正常組比較，各腸道菌群數量增加差異無統計學意義。與模型組組比較，各腸道菌群的數量差異有統計學意義(P<0.05)，說明金番止瀉膠囊具有扶植正常菌群生長和調整菌群失調的作用；且金番止瀉膠囊高劑量組與陽性組差異無統計學意義，而低劑量組腸道菌群的恢復效果低于陽性組。

3.2 體外抗菌作用

表2顯示，取滅菌后番金止瀉膠囊10 g用無菌生理鹽水溶化備用(含藥量為6.7 g.100 mL-1)。將菌種接種到100 mL營養肉湯培養基中，搖床37 ℃擴菌24 h。吸取菌懸液0.5 mL于無菌試管中，加4.5 mL無菌生理鹽水定容10倍稀釋。精密移取滅菌過的15 mL營養瓊脂于試管中，用1 mL無菌滴管分別移取0.2 mL 10-5～10-9各濃度的菌懸液于試管中，搖勻后倒入培養皿中，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，無菌紙片含各藥物500 μg。測量抑菌圈的直徑大小。

試管2倍稀釋法：各取2 mLMH肉湯分別加入10支無菌試管中。1號管加入藥液2 mL混合均勻后吸移取2 mL加入2號管,依法稀釋至8號管，吸取2 mL棄去，10號管為肉湯無菌生長對照管，9號管為細菌生長對照管。除10號管，用無菌加樣器在其余各管中加入菌液100 μL，置于37 ℃恒溫箱內培養16 h。凡澄清透明的管定為無菌生長，以無菌生長的最高藥物稀釋度為該藥液對細菌的MIC。

表2 金番止瀉膠囊體外抗菌實驗結果

3.3 金番止瀉膠囊的體外抗菌作用

表2顯示，番金止瀉膠囊痢疾桿菌、金葡球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有抑菌活性作用。

試管2倍稀釋法結果顯示，番金止瀉膠囊對痢疾桿菌、金葡球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌的MIC(mg·mL-1)依次為8.27、6.40、7.60、8.51、12.80。

4 討論

小鼠脾虛模型的制備方法較多，如過度抗生素法[5]番瀉葉瀉下致脾虛模型是大家公認的方法[6]但考慮飲食失節疲倦過度也可致脾虛，故本實驗采用番瀉葉瀉下加隔天禁食法制備小鼠脾虛模型。本實驗中，脾虛小鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌數量有所減少，可能是因為腹瀉嚴重導致腸道內常駐菌大量排出，以致腸道內微生態失調，經金番止瀉膠囊治療后，菌落數趨于恢復正常，且高劑量(1.2 g·kg-1) 作用更好，有量效關系。

金番止瀉膠囊對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌等所選細菌在體外均有明顯的抑菌作用，抑菌圈邊緣清晰，與黃連小檗堿進行對照，但效果不及黃連小檗堿。

[1] 譚年秀，郭巧玲，田素英．金櫻根的藥用歷史及現代研究概況[J]．亞太傳統醫藥，2010,6(12)：167- 169．

[2] 賴岳曉,嚴寒靜,田素英,等.金櫻根提取物體外抑菌活性的實驗研究[J].今日藥學，2012,22(9):531- 433．

[3] 王芳,王力,董樂,等．番石榴葉提取物的鑒定及其抗菌作用[J].分子科學學報，2007，3(5):365- 367．

[4] 高云芳,姚洋.不同劑量四君子湯對脾虛證小鼠消化和免疫功能的影響[J].中草藥,2007,38(4):558- 562．

[5] 王艷,張立,田素英,等.金櫻根、金櫻莖多糖對腸道菌群失調小鼠調整作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(20):270- 272.

[6] 陳學習.脾虛證動物模型復制方法研究概況評價與思考[J].中國當代醫藥,2010,17(33):5- 6.

Effect of Jinfan Zhixie Capsule on Gut Flora in Spleen- deficiency Mice and in Vitro Bacteriostasis

LIU Pei- yi1, LAI Yue- xiao1, TIAN Su- ying2,3△

(1. Zhongshan Huangpu People's Hospital,Zhongshan Guangdong 5284292,China; 2. Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou Guangdong 510006,China; 3. Guangdong Cosmetics Engineering & Technology Research Center,Guangzhou 510006,China)

Objective: To observe the effects of gut flora in spleen- deficiency mice and in vitro bacteriostasis of Jinfan Zhixie Capsule(JZC).Methods: Establishing the spleen- deficiency mice model with senna extract and fully and poorly feeding food in turn,and then detect the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus and Escherichia coli in mice cecum contents by colo- ny counting after treated with JZC.By filtering paper method and tube double dilution method to inspec the bacteriostasis effect for Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi on JZC. Results: Compared with the normal control group，the number of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,and Escherichia coli in mice cecum contents increased in model group.After treated with the 1.2 g·kg-1and 0.6 g·kg-1of JZC，all the indexes have certain recovery and close to the normal level. The MIC values(mg·mL-1)againsts Bacillus subtilis,Escherichiacoli,Staphylococcus aureus,Shigella,Salmonellatyphi respectively were 12.8、8.51、6.4、7.6、8.27.Conclusion JZC has dependent manner recovered the gut flora in spleen- deficiency mice,and in vitro bacteriostasis.

Jinfan Zhixie capsule; Spleen deficiency; Gut flora; in vitro bacteriostasis

廣東省中醫藥局建設中醫藥強省課題項目 (20151126); 2014 年廣東省大學生創新創業訓練計劃項目(2014036);廣東藥科大學“創新強校工程”醫藥化工省級實驗教學示范中心資助項目

劉佩沂(1976-)，女，主任藥師，從事中藥學的臨床與研究。

△通訊作者：田素英，從事中藥應用教學與研究，Tel：15362965291,E-mail:zsxqtsy@126.com。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0937- 02

2017-03-16