TIMP-3啟動子區(qū)基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死患病的相關(guān)性研究

孫祥榮，許 可，劉曙東

TIMP-3啟動子區(qū)基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死患病的相關(guān)性研究

孫祥榮，許 可，劉曙東

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(TIMP-3)啟動子區(qū)基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。方法 選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例(病例組)，同時選取健康自愿者400名作為對照組。分析TIMP-3基因啟動子區(qū)-915位點(rs2234921)多態(tài)性。結(jié)果 TIMP-3啟動子區(qū)-915位點(rs2234921)PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后，有3種基因型，包括GG型、AG型和AA型；病例組和對照組基因型及等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%，明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 TIMP-3啟動子區(qū)-915位點(rs2234921)多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死易感性有關(guān)，有望成為高危人群篩選標(biāo)志以及干預(yù)靶點。

腦梗死；動脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3；基因多態(tài)性

動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生發(fā)展，可以導(dǎo)致病人腦血管的阻塞，進(jìn)而導(dǎo)致腦梗死或者腦出血的發(fā)生，臨床預(yù)后較差。流行病學(xué)研究顯示，動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病率接近0.06%～0.16%，在部分地區(qū)的發(fā)病率可進(jìn)一步上升[1]。 基礎(chǔ)研究顯示，基因水平的變化對于腦梗死的發(fā)生具有重要的影響，相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或者調(diào)節(jié)水平活性的改變，可以通過促進(jìn)動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進(jìn)脂質(zhì)或者泡沫細(xì)胞在動脈內(nèi)皮組織中的沉積，導(dǎo)致動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的進(jìn)展[2- 3]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑3(matrix metalloproteinase 3，TIMP-3)可以影響到動脈血管內(nèi)皮組織中膠原成分的降解，促進(jìn)單核細(xì)胞的浸潤等，進(jìn)而參與到腦梗死的發(fā)生過程中[4-6]。為了進(jìn)一步揭示TIMP-3的基因多態(tài)性對于腦梗死發(fā)生的影響，本研究選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例，探討TIMP-3啟動子區(qū)基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月—2016年10月在我院治療的腦梗死病人394例(病例組)，其中男性221例，女性173例；年齡43歲～84歲(65.40歲±8.79歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合缺血性卒中診治指南中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]；均經(jīng)頭顱CT、MRI確診；均為初次發(fā)病，相互間無血緣關(guān)系；病人及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：有癥狀性腦梗死、梗死后出血和腦出血；有系統(tǒng)性炎性疾病、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病、結(jié)核、腫瘤性卒中等。同時選取健康自愿者400名(對照組)，男性244名，女性156名，年齡41歲～82歲(64.84歲±10.22歲)。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測方法 取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4 ℃冰水采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá)20 μL，上機，反應(yīng)條件為：93℃2 min、93℃ 1 min。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分析 TIMP-3啟動子區(qū)-915位點(rs2234921)PCR擴(kuò)增片段經(jīng)酶切后，有3種基因型，包括GG型、AG型和AA型。詳見圖1。

注：M為DNA標(biāo)記物；1，5為GG型；2，4為GA型；3為AA型

圖1 電泳結(jié)果

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 病例組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，說明病例組和對照組樣本具有代表性。詳見表1。

表1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 兩組基因型及等位基因比較 病例組和對照組基因型及等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%，明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組基因型及等位基因分布比較 例(%)

3 討 論

腦血管或者頸部動脈血管內(nèi)皮的長期損傷，影響到了內(nèi)皮細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致脂質(zhì)細(xì)胞、低密度脂蛋白或者三酰甘油的沉積，血管內(nèi)皮的粥樣硬化性改變較為明顯，血管的狹窄較為嚴(yán)重。一項匯集了192例樣本量的臨床隨訪研究顯示，動脈粥樣硬化導(dǎo)致的腦梗死發(fā)生占到了各種病因腦梗死的35%以上，且其病情進(jìn)展較為迅速，病人病死率較高，遠(yuǎn)期致殘率或者生存預(yù)后較差[7-8]。而對于腦梗死病人相關(guān)基因表達(dá)水平的生物學(xué)標(biāo)志物研究，可以為動脈粥樣硬化性腦梗死的基因治療提供理論依據(jù)，并可以為揭示腦梗死的發(fā)病機制提供參考。

TIMP-3作為蛋白酶抑制劑家族成員，其持續(xù)性的活化或者轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的上調(diào)，在影響到動脈血管內(nèi)皮的過氧化損傷、加劇細(xì)胞炎癥因子的浸潤，黏附低密度脂蛋白等方面，均發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。TIMP-3的啟動子水平的多態(tài)性演變，在調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄活性，影響到沉默子的表達(dá)等方面具有一定的作用，最終可以影響到TIMP-3蛋白的表達(dá)參與到多種生物進(jìn)程中[9- 10]。TIMP-3在心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病的發(fā)生中具有一定的積極作用，已有研究探討了TIMP-3在促進(jìn)急性冠脈綜合征發(fā)生中的作用，認(rèn)為高表達(dá)的TIMP-3可以加劇病人心肌細(xì)胞的缺血程度[11-12]，但對于TIMP-3多態(tài)性在腦梗死中的研究不足。兩組病例中的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，提示兩組基因型表達(dá)中G及A位點的表達(dá)符合正太分布規(guī)律，無異常突變導(dǎo)致的臨床資料的選擇偏倚產(chǎn)生，提示了本次研究的科學(xué)性。

在本次研究中， TIMP-3擴(kuò)增后進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)其主要包括3種基因型，GG型、AG型和AA型，提示G基因型的表達(dá)或者A基因型的可能是促進(jìn) TIMP-3對于動脈粥樣硬化發(fā)生的主要因素，G基因型的表達(dá)或者A基因型多態(tài)性位點的變化，可以在影響到TIMP蛋白羧基末端的轉(zhuǎn)錄活性，改變其四級空間結(jié)構(gòu)的修飾，或者通過磷酸化進(jìn)而影響到TIMP的生物活性，加劇其對于粥樣硬化發(fā)生的促進(jìn)作用。鄭周等[13-14]前瞻性收集分析研究了82例樣本，發(fā)現(xiàn)G基因型的異常表達(dá)或者等位位點的異常，是加劇腦梗死病人腦組織缺血性壞死的重要因素，且G基因型的位點突變效應(yīng)越為明顯，腦梗死病人遠(yuǎn)期的生存預(yù)后越差，相關(guān)性較為顯著，這與本研究的結(jié)論較為相似。另外，更為重要的是，在分析不同等位基因的表達(dá)過程中，本研究發(fā)現(xiàn)病例組基因GG型和等位基因G比例分別為27.67%和50.38%，均明顯高于其他基因型，特別是A基因型或者等位基因，提示GG或者G等位基因的表達(dá)，是促進(jìn)粥樣硬化性腦梗死發(fā)生的風(fēng)險因素，GG或者G等位基因的表達(dá)可以在下列因素方面影響到腦梗死的發(fā)生：①GG或者G等位基因的高表達(dá)，加劇了TIMP-3蛋白對于Ⅳ型膠原纖維蛋白的降解作用，影響到了動脈血管的中層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血管容易發(fā)生破裂出血或者栓塞；②GG或者G等位基因在抑制啟動子序列中不同可轉(zhuǎn)錄區(qū)的活性上，具有顯著的影響，持續(xù)性的啟動子區(qū)域的激活效應(yīng)，上調(diào)了下游脂質(zhì)代謝紊亂的可能性，特別是低密度脂蛋白的代謝異常可以進(jìn)一步影響到腦梗死的發(fā)生。

綜上所述，TIMP-3啟動子區(qū)-915位點(rs2234921)多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死易感性有關(guān)，有望成為高危人群篩選標(biāo)志以及干預(yù)靶點。

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(本文編輯王雅潔)

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院( 四川南充 637099)，E-mail：yangshuangyanoi@163.com

信息：孫祥榮，許可，劉曙東.TIMP-3啟動子區(qū)基因的多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死患病的相關(guān)性研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(15)：1930-1932.

R743.33 R255.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.040

1672-1349(2017)15-1930-03

2017-06-08)