大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體構建

李建，張磊，張媛，彭國瑞，王秀麗，劉博，辛凌翔，羅玉峰，蔣玉文

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體構建

李建，張磊，張媛，彭國瑞，王秀麗，劉博，辛凌翔，羅玉峰，蔣玉文*

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

合成胸膜肺炎放線桿菌質粒pKMA2425上長度為126 bp及2214 bp的2個DNA片段，克隆到大腸埃希氏菌質粒pGSI中，獲得重組質粒pGSIA。PCR擴增pTKRED上的大觀霉素抗性基因及線性化的pGSIA(126 bp DNA片段-pGSI-2214 bp DNA片段)，連接，電轉化胸膜肺炎放線桿菌，在大觀霉素的選擇壓力下篩選鑒定到連接正確的質粒，命名為pGSIAS。pGSIAS測序結果符合預期。在大觀霉素的選擇壓力下，含有pGSIAS的胸膜肺炎放線桿菌血清1～10型菌株均生長良好；在氨芐青霉素的選擇壓力下，含有pGSIAS的大腸埃希氏菌生長良好。結果表明本研究構建的大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體pGSIAS序列正確，在胸膜肺炎放線桿菌及大腸埃希氏菌中均能復制并表達質粒上的相關基因。

大腸埃希氏菌；胸膜肺炎放線桿菌；穿梭載體

豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)，又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)[1]引起的一種豬高度傳染性呼吸道疾病。該病于1957年由Pattison等[2]首次報道，此后逐漸擴散，目前已遍布世界各地，在美洲(美國、加拿大、墨西哥)、歐洲(瑞士、瑞典、丹麥)、澳大利亞、亞洲(日本、韓國和中國[3])等地均有流行，但各地方所流行的血清型不盡相同。1～4月齡的豬感染時死亡率為5%～30%，在新引進豬群中多呈急性爆發，發病率和死亡率在20%以上，最急性的死亡率可高達80%～100%[4]。由于各個豬場的免疫情況不同，死亡率也不盡相同[5]。1989年國外報道APP導致豬平均日增重下降33.6%,飼料報酬下降25.5%[6]。研究證實，預防和控制本病最有效的措施仍然是疫苗免疫接種。從臨床上觀察到，無論是自然感染還是通過人工方法感染APP后存活的豬，均獲得了對所有血清型菌株再次感染的免疫保護力，暗示若干保護性抗原或免疫復合物可能在交叉保護中起著關鍵性的作用，這些成分可能僅在病原感染動物時被誘導產生，而在動物體外用培養基培養時并不產生。因此，弱毒活疫苗有可能解決傳統滅活疫苗、亞單位疫苗及菌影疫苗等交叉保護力不理想的問題。

利用DNA定點同源重組技術可快速對特定DNA片段進行缺失、置換或插入，用以構建減毒株。大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體是該平臺技術的重要元件，如攜帶重組酶表達元件，則可極大提高同源重組效率；同時，也可攜帶其他基因表達元件或基因沉默元件，通過基因的過量表達、表達量減少或完全抑制表達來實現對該基因功能的研究。本研究以大腸埃希氏菌質粒pGSI、胸膜肺炎放線桿菌pKMA2425及大觀霉素抗性基因為元件，構建大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒 pTKRED購自NTCC典型培養物保藏中心。

1.1.2 培養基 普通瓊脂、普通肉湯、TSA、TSB均購自北京中海生物科技有限公司；氨芐青霉素購自Amresco公司；大觀霉素購自上海江萊生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PCR產物回收試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司；USERTM酶購自NEB公司；PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 合成DNA片段 合成胸膜肺炎放線桿菌質粒pKMA2425(Genbank：AJ830714.1)20～145 bp片段(全長126 bp)及962～19 bp(全長2214 bp)，克隆到大腸埃希氏菌質粒pGSI中，命名為pGSIA。

1.2.2 引物設計與合成 利用軟件Oligo6.7.1.0進行引物的設計，各DNA片段所需引物見表1。

1.2.3 提取質粒 在含100 μg/mL氨芐青霉素的普通肉湯中培養含pGSIA的大腸埃希氏菌，提取pGSIA，溶于超純水。在含100 μg/mL大觀霉素的普通肉湯中培養含pTKRED的大腸埃希氏菌，提取pTKRED，溶于超純水。

1.2.4 PCR擴增構建穿梭載體所需元件 以環狀pGSIA為模板擴增線性pGSIA，以pTKRED為模板擴增大觀霉素抗性基因。膠回收，溶于TE，測定DNA濃度。

1.2.5 載體連接 線性pGSIA 0.01 pmol，大觀霉素抗性基因0.1 pmol，USERTM enzyme mix 1 μL，TE補足10 μL。37 ℃反應20 min，25 ℃反應20 min，用PCR產物回收試劑盒回收連接產物。

表1 引物Tab 1 Primers

1.2.6 電轉化 用胸膜肺炎放線桿菌血清4型菌株制備電轉化感受態細胞，將回收的連接產物電轉化到感受態細胞中，電轉化參數為電壓2.5 kV，電容25 μF，脈沖電阻800 Ω。非抗性復蘇3 h，涂布含100 μg/mL大觀霉素的平板。

1.2.7 載體的測序鑒定 取單菌落培養后提取質粒，送交中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。

1.2.8 穿梭質粒復制表達能力驗證 鑒定正確的質粒命名為pGSIAS(圖1)，取pGSIAS轉化大腸埃希氏菌DH5α感受態細胞，非抗性復蘇3 h后，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素的平板。取單菌落培養后，提取質粒，電轉化胸膜肺炎放線桿菌血清1～3及5～10型菌株，非抗性復蘇3 h后，涂布含100 μg/mL大觀霉素的平板。取含pGSIAS的大腸埃希氏菌單菌落接種含100 μg/mL氨芐青霉素的普通肉湯，取含pGSIAS的胸膜肺炎放線桿菌接種含100 μg/mL大觀霉素、0.001% NAD及8%胎牛血清的TSB，37 ℃ 200 r/min培養24 h，觀察細菌是否生長。

1.2.9 含穿梭質粒菌株的鑒定 PCR擴增含pGSIAS的大腸埃希氏菌及胸膜肺炎放線桿菌血清1～10型菌株的16SrDNA片段，送交中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。對胸膜肺炎放線桿菌血清1～10型菌株進行血清型鑒定。

2 結果與分析

2.1 pGSIA序列分析 用DNAMAN7.0.2.176對pGSIA測序結果與預期序列進行比對，結果同源性為100%，符合預期。

2.2 載體元件PCR擴增結果 以環狀pGSIA為模板擴增出了全長為5212 bp的線性pGSIA(圖2)，以pTKRED為模板擴增出了全長為1026 bp的大觀霉素抗性基因(圖3)。上述兩個DNA片段用于拼接穿梭載體。

M:DL10000 DNA Marker1: 線性pGSIA PCR產物1: linear pGSIA PCR product圖2 線性pGSIA PCR產物電泳圖Fig 2 Electrophoresis photo of linear pGSIA PCR product

M: DNA Marker II1: 大觀霉素抗性基因PCR產物1: Spectinomycin resistance gene PCR product圖3 大觀霉素抗性基因PCR產物電泳圖Fig 3 Electrophoresis photo of spectinomycin resistance gene PCR product

2.3 pGSIAS序列分析 用DNAMAN7.0.2.176對pGSIAS測序結果與預期序列進行比對，結果同源性為100%，符合預期。

2.4 穿梭質粒pGSIAS功能驗證 含有pGSIAS的大腸埃希氏菌DH5α株在100 μg/mL氨芐青霉素的選擇壓力下生長良好；含有pGSIAS的胸膜肺炎放線桿菌血清1～10型菌株在100 μg/mL大觀霉素的選擇壓力下生長良好；結果表明pGSIAS在大腸埃希氏菌及胸膜肺炎放線桿菌中均能正常復制，在大腸埃希氏菌中可表達氨芐青霉素抗性基因，在胸膜肺炎放線桿菌中可表達大觀霉素抗性基因，證明pGSIAS是大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭質粒載體。

2.5 含有穿梭質粒pGSIAS的菌株的鑒定 大腸埃希氏菌DH5α株及胸膜肺炎放線桿菌血清1～10型菌株均擴增出了全長為1505 bp的16SrDNA片段(圖4)，測序結果與Genbank上的序列進行比對，結果表明上述11株菌株均不是雜菌。胸膜肺炎放線桿菌間接血凝試驗結果表明10株胸膜肺炎放線桿菌的血清型均與對應標識一致。

M:DL2000 DNA Marker; 1～11: 16SrDNA片段PCR產物1～11:16SrDNA fragment PCR product圖4 16SrDNA片段PCR產物電泳圖Fig 4 Electrophoresis photo of 16SrDNA fragment PCR product

3 討論與小結

穿梭質粒具有兩套來源于不同生物的復制子及選擇標記元件，可以克服親緣關系較遠的兩種生物在遺傳上的障礙，實現同一質粒同時在不同生物體內的復制[8]。由于大腸埃希氏菌操作簡便成熟，其質粒拷貝數高，重組質粒易于大量制備，研究者偏愛構建在大腸埃希氏菌中的穿梭載體。

Guy Lalonde等[9]構建了第1個大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌放線桿菌穿梭載體pYG53。J. Frey[10]構建了7800 bp的大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌放線桿菌穿梭載體pJFF224-NX及pJFF224-XN。本研究構建的大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌放線桿菌穿梭載體pGSIAS全長6220 bp，容納外源DNA片段的能力比pJFF224-NX及pJFF224-XN更大。

pGSIAS在10種血清型胸膜肺炎放線桿菌中均能正常復制，穩定遺傳，有效表達大觀霉素抗性基因，表明該載體具有大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌放線桿菌穿梭質粒載體的相關功能。本試驗操作中，在轉化步驟可能由質粒溶液帶入雜菌，影響實驗結果的可靠性，因此，本試驗在轉化的后續操作中挑取單菌落開展試驗，并且對相關菌株進行了定種鑒定，16SrDNA片段序列比對結果確定了試驗過程中未污染雜菌，胸膜肺炎放線桿菌間接血凝定型試驗結果確定了未發生血清型間交叉污染。上述結果表明穿梭質粒pGSIAS功能驗證結果可靠。

本研究構建了大腸埃希氏菌-胸膜肺炎放線桿菌穿梭載體pGSIAS，并對其穿梭功能進行了驗證，可以此為基礎，進一步開展疫苗開發及基因功能研究等方面的工作。

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(編輯：侯向輝)

Construction ofEscherichiacoli-ActinobacilluspleuropneumoniaeShuttle Vector

LI Jian, ZHANG Lei, ZHANG Yuan, PENG Guo-rui, WANG Xiu-li, LIU Bo, XIN Ling-xiang, LUO Yu-feng, JIANG Yu-wen*

(China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081,China)

Jiang Yu-wen,E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

A 126bp-length DNA fragment and a 2214bp-length DNA fragment fromActinobacilluspleuropneumoniaeplasmid pKMA2425 were synthesized and then cloned into pGSI. The constructed recombinant plasmid was named pGSIA. Spectinomycin resistance gene amplified by PCR from pTKRED and linear pGSIA(126bp-length DNA fragment+pGSI+2214 bp-length DNA fragment) amplified by PCR from circular pGSIA were ligated together and then transformed intoActinobacilluspleuropneumoniaeby electroporation. In the selection pressure of spectinomycin, correctly ligated recombinant plasmid was gained by PCR identification and named pGSIAS. Sequencing result of pGSIAS was as expected. In the selection pressure of spectinomycin,Actinobacilluspleuropneumoniaeserotypes 1～10 containing pGSIAS growed well. In the selection pressure of ampicillin,Escherichiacolicontaining pGSIAS growed well. The results showed that the sequence ofEscherichiacoli-Actinobacilluspleuropneumoniaeshuttle vector pGSIAS was correct. In addition, pGSIAS could replicate itself and express related genes on the vector inActinobacilluspleuropneumoniaeorEscherichiacoli.

Escherichiacoli;Actinobacilluspleuropneumoniae;shuttle Vector

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.01

國家重點研發計劃資助項目(2016YFC1202303)

李建，碩士，從事獸用生物制品研究。

蔣玉文。E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

2017-01-18

A

1002-1280 (2017) 08-0001-05

S852.61