HPLC-ELSD法測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量

張聰，楊強(qiáng)，樊麗博，張繼穎，張曉會(huì)

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550004)

HPLC-ELSD法測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量

張聰1，楊強(qiáng)2，樊麗博1，張繼穎1，張曉會(huì)1

(1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，洛陽 471000；2.貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽 550004)

為了建立五加芪粉中黃芪甲苷的含量測定方法，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(HPLC-ELSD)法，色譜柱為Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水35∶65，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；采用ELSD檢測器，漂移管溫度為60 ℃，噴霧器溫度為36 ℃，氮?dú)鈮毫?5 psi。結(jié)果顯示黃芪甲苷在1.524～10.16 μg(r=0.9991)之間的對數(shù)值與峰面積的對數(shù)值呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為99.4%，RSD=4.6%(n=6)。本方法重復(fù)性良好，能準(zhǔn)確測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，對其質(zhì)量進(jìn)行控制。

五加芪粉；黃芪甲苷；HPLC-ELSD法

五加芪粉具有補(bǔ)中益氣、扶正祛邪的功效，用于提高禽的機(jī)體免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。五加芪粉處方由黃芪和刺五加兩味藥材組成，其中黃芪為君藥。黃芪主要化學(xué)成分為多糖類[1]、皂苷類[2]及黃酮類[3]等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪具有顯著的免疫增強(qiáng)作用[4-5]，可提高畜禽免疫力，廣泛用于現(xiàn)代化畜禽養(yǎng)殖。黃芪甲苷做為黃芪提升免疫的主要活性成分[6]，是控制黃芪及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，因此將其做為控制五加芪粉質(zhì)量的指標(biāo)。本文研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜系統(tǒng)(Waters e2695型HPLC；2424型ELSD；Empower 2色譜工作站軟件)；Kromasil 100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典AKZO NOBLE公司；AB265-S電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；HS3120型超聲波清洗器；甲醇、正丁醇、氨水為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品，含量：100%，批號(hào)：110781-200613，中國食品藥品檢定研究院；五加芪粉，規(guī)格：1 g相當(dāng)于3.3 g生藥，批號(hào)：20120201、20120202、20120203，由洛陽惠中獸藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱為Kromasil 100-5C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(35∶65)；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；ELSD檢測器：漂移管溫度為60 ℃，噴霧器溫度為36 ℃，氮?dú)鈮毫?5 psi。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 溶液配制

2.2.1 黃芪甲苷對照品溶液制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50 mL甲醇超聲提取30 min，抽濾，濾渣連同濾紙放回錐形瓶中，再加50 mL甲醇超聲提取30 min，抽濾，用30 mL甲醇洗滌濾渣和濾紙，合并濾液，減壓回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次約40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度、搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液制備 取制備的缺黃芪陰性樣品適量(相當(dāng)于刺五加1.2 g)，置具塞錐形瓶中，照2.2.2項(xiàng)下操作制備成陰性對照溶液。

2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液5、15 μL，供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 照上述2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液15 μL、供試品溶液10 μL、陰性對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對照溶液在黃芪甲苷對照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾，見圖1。

2.4.2 線性 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解制成濃度為0.5080 mg/mL的對照品溶液，依次精密吸取3、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，以黃芪甲苷峰面積的對數(shù)值(y)為縱坐標(biāo)、黃芪甲苷進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=1.4828x+5.312(r=0.9991)。結(jié)果表明，在1.524～10.16 μg范圍內(nèi)，黃芪甲苷峰面積對數(shù)值與進(jìn)樣量對數(shù)值線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖2。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得黃芪甲苷峰面積RSD為0.8%，結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的供試品(批號(hào)：20120201)2 g，按上述2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，測得黃芪甲苷的平均含量為2.7 mg·g-1，RSD為1.6%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，測得黃芪甲苷含量的RSD為2.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品(批號(hào)：20120201)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5380 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液5 mL，平行操作6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，測定并計(jì)算加樣回收率，測得平均回收率為99.4%，RSD為4.6%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

1.黃芪甲苷對照品 2.供試品 3.陰性對照1. Reference Substance of Astragaloside 2. Test sample 3. negative control圖1 專屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

圖2 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The standard curve of Astragaloside

編號(hào)No.樣品稱量/gAmountofsample對照加入量/mgAmountofreferencesubstance測得總量/mgAmountofmesured回收率/%Recovery平均值/%meanRSD/%11.01042.695.2695.7320.97092.695.1495.2530.96722.695.1395.1541.04962.695.60104.4551.02642.695.47101.7861.01982.695.51104.1799.44.6

2.4.7 樣品測定 取3批供試品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定，計(jì)算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 The results of sample content determination

3 討 論

3.1 黃芪甲苷含量測定方法的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道的黃芪甲苷含量測定方法有熒光分光光度法[7]、薄層色譜掃描法[8]、高效液相色譜法[9]等，其中高效液相色譜法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，且使用蒸發(fā)光散射檢測器可解決黃芪甲苷紫外吸收弱的缺點(diǎn)，是黃芪甲苷含量測定的常用方法。

3.2 提取溶劑和提取方法的選擇 五加芪粉為黃芪和刺五加經(jīng)水提、純化、噴霧干燥制成的粉劑，含有較多的多糖類成分，為了充分提取其中的黃芪甲苷，參考同類制劑的供試品溶液制備方法[10-11]，選擇甲醇作為提取溶劑，分別對熱回流法和超聲提取法進(jìn)行對比，結(jié)果表明兩種方法提取效果相當(dāng)，考慮超聲提取較為簡便，因此選擇超聲提取法。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，超聲提取1次不能將黃芪甲苷提取完全，提取2次和提取3次結(jié)果差別不大，因此選擇超聲提取2次，并且最后用甲醇洗滌殘?jiān)员ＷC黃芪甲苷充分轉(zhuǎn)移。

3.3 萃取次數(shù)的選擇 參考黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定方法[9]，對正丁醇萃取次數(shù)進(jìn)行了考察，分別進(jìn)行3次、4次、5次萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取4次之后，黃芪甲苷基本完全轉(zhuǎn)移，因此確定采用正丁醇萃取4次。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正丁醇萃取液蒸干后再通過D101型大孔吸附樹脂柱純化，黃芪甲苷的回收率相對較低，而且未經(jīng)大孔吸附樹脂柱純化的樣品在含量測定過程中不受其他雜質(zhì)的影響，因此，確定正丁醇后不再通過大孔吸附樹脂柱純化，直接用甲醇溶解測定。

3.4 色譜條件的考察 參考黃芪藥材中黃芪甲苷的含量測定色譜條件[9]，分別對流動(dòng)相的比例、柱溫、流速、柱子型號(hào)進(jìn)行考察，結(jié)果表明黃芪甲苷的色譜行為受流動(dòng)相比例影響較大，其他條件對其影響相對較小，綜合系統(tǒng)適用性各指標(biāo)，確定流動(dòng)相的比例為乙腈-水(35∶65)，此時(shí)黃芪甲苷保留時(shí)間約7 min，更加適合該產(chǎn)品的檢測。此外，對蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度進(jìn)行了考察，60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下黃芪甲苷峰各項(xiàng)指標(biāo)差別不大，因此設(shè)定漂移管溫度為60 ℃。

本研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定五加芪粉中黃芪甲苷的含量，在該色譜條件下，黃芪甲苷分離度良好，保留時(shí)間適宜，方法學(xué)考察表明該方法專屬性、精密度、重復(fù)性良好，可準(zhǔn)確測定黃芪甲苷的含量，從而有效控制五加芪粉的質(zhì)量。

[1] 劉楊, 包華音, 劉德麗. 黃芪多糖提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)選與含量測定[J]. 食品與藥品, 2014, 16(5): 318-320.

Liu Y, Bao H Y, Liu D L. Optimization of extraction technology by orthogonal test and determination of polysaccharides in astragali radix[J]. Food and Drug, 2014, 16(5): 318-320.

[2] 卞云云, 管佳, 畢志明, 等. 蒙古黃芪的化學(xué)成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(16):1217-1221.

Bian Y Y, Guan J, Bi Z M,etal. Studies on chemical constituents of astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2006, 41(16):1217-1221.

[3] 馬曉豐, 田曉明, 陳英杰, 等. 內(nèi)蒙黃芪中黃酮類成分的研究[J]. 中草藥, 2005, 36(9): 1293-1296.

Ma X F, Tian X M, Chen Y J,etal. Flavonoid constituents of astragalus membranaceus var. mongholicus[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2005, 36(9): 1293-1296.

[4] 劉必旺, 吉海杰, 許凱霞, 等. 黃芪甲苷對免疫低下糖尿病大鼠的影響[J]. 山西中醫(yī), 2013, 29(8): 45-49.

Liu B W, Ji H J, Xu K X,etal. The effect of astragaloside on hypofunction of immunity of diabetes rat[J]. Shanxi Journal of Traditional Chinese Medicine, 2013, 29(8): 45-49.

[5] 王德云, 胡元亮, 孔祥峰, 等. 中藥成分對雛雞外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2004, 24(6): 578-580.

Wang D Y, Hu Y L, Kong X F,etal. Effects of Chinese herbal medicinal ingredients on peripheral T lymphocyte transformation in chicken[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2004, 24(6): 578-580.

[6] 段立軍, 孫博航. 黃芪甲苷的研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(5): 410-416.

Duan L J, Sun B H. Research reviews on astragaloside Ⅳ[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2011, 28(5): 410-416.

[7] 韓素琴, 劉養(yǎng)清, 任榮芳. 香蘭素?zé)晒夥y定黃芪口服液中的黃芪甲苷[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002, 22(1): 75-77.

Han S Q, Liu Y Q, Ren R F. Determination of astragaloside in huangqi oral liquid by spectrophotofluorimetry[J]. Journal of Shanxi Agricultural University(Nature Science Edition), 2002, 22(1): 75-77.

[8] 倪晟, 趙培潔, 鄭燕, 等. 薄層掃描法測定扶正膠囊中黃芪甲苷的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1999, 34(1): 45-47.

Ni S, Zhao P J, Zheng Y,etal. Determination of astragaloside in Fuzheng capsules by TLC scanning[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 1999, 34(1): 45-47.

[9] 中國獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國獸藥典2010年版 [S].

The Chinese Veterinary Drug Standard Committee. Veterinary drug standard of the People's Republic of China, 2010 [S].

[10]陳錫琨. HPLC-ELSD法測定玉屏風(fēng)膠囊中黃芪甲苷的含量[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2013, 11(23): 8-9.

Chen X K. Determination of astragaloside the content in jade screen capsules by HPLC-ELSD[J]. Guide of China Medicine, 2013, 11(23): 8-9.

[11]農(nóng)業(yè)部獸藥評(píng)審中心. 獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編(2012年)[S].

The Ministry of Agriculture Veterinary Drug Evaluation center. Veterinary drug quality standards 2012 [S].

(編輯：陳希)

Determination of Astragaloside in Wujiaqi Powder by HPLC-ELSD

ZHANG Cong1, YANG Qiang2, FAN Li-bo1, ZHANG Ji-ying1, ZHANG Xiao-hui1

(1. National Research Center for Veterinary Medicine/Luoyang Huizhong Veterinary Medicine Co., Ltd, Luoyang 471000, China;2. Guizhou Province Institute of Veterinary Drug and Feedstuff, Guiyang 550004, China)

To establish the method for determining of astragaloside in Wujiaqi powder by HPLC-ELSD, C18 column (Kromasil 100-5C18, 150 mm×4.6 mm, 5μm)was used with the mobile phase consisted of acetonitrile-water (35∶65), the flow rate was 1.0 mL/min, column temperature was 30 ℃, Evaporative light scattering detection condition: drift tube temperature was 60 ℃, spray tube temperature was 36 ℃, the nitrogen pressure was 25 psi. The calibration curve was linear at a range of 1.524～10.16 μg for astragaloside (r=0.9991), the average recovery was 99.4% andRSDwas 4.6%(n=6). The method was accurate with a good reproducibility and can be used as a quantitative analysis of astragloside in Wujiaqi powder.

Wujiaqi powder; astragaloside; HPLC-ELSD

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.11

張聰，碩士，從事新獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。E-mail: zhangcong301@163.com

2017-03-29

A

1002-1280 (2017) 08-0062-05

S853.7