可樂定ELISA檢測試劑盒的研制及其性能評價

李丹妮 ，顧欣，黃華，陸沛嗣，王學生，黃士新*

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103；2.上海容暉生物科技有限公司，上海 200231)

可樂定ELISA檢測試劑盒的研制及其性能評價

李丹妮1，顧欣1，黃華2，陸沛嗣2，王學生2，黃士新1*

(1.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103；2.上海容暉生物科技有限公司，上海 200231)

通過制備可樂定完全抗原，免疫新西蘭大白兔，得到特異性多克隆抗體，和HRP標記的羊抗兔構建間接ELISA檢測法試劑盒，并進行性能測試評價。結果表明，吸光度百分比值與可樂定質量濃度的對數在0.1～8.1 μg/L呈線性關系，相關系數R2為0.977，半數抑制濃度(IC50)為0.675 ng/mL，檢測限為0.2 ng/mL，在濃度為0.15～0.5 ng/mL添加范圍內，回收率為81%～109%，具備良好的特異性，可用于動物尿樣、血清和組織中的可樂定殘留檢測。

可樂定；酶聯免疫吸附測定；多克隆抗體；試劑盒

可樂定(Clonidine)化學名[2-(2,6-二氯苯基)亞氨基]咪唑啉，是一種通過刺激腦干α2-腎上腺受體動劑，能抑制中樞神經降低血壓藥物。同時可樂定是咪唑啉衍生物具有激發與促進垂體增加分泌生長激素(GH)的作用，故可樂定還可提高動物生長和改善胴體品質[1-3]，畜禽類飼養含有可樂定的飼料可以增加畜禽類體重和瘦肉率，但可樂定毒副作用大、易積累，食用含有可樂定殘留的動物源性食品，對人體健康具有相當的危害。農業部2010年發布了1519號公告，向社會公布了禁止在飼料、動物飲用水和畜禽水產養殖過程中使用的藥物和物質清單，可樂定已明確被列入其中[4]。

近年來由于國家對瘦肉精類藥物的監管力度不斷加大，加強對飼料、經濟動物尿樣的可樂定殘留檢測是保障食品安全重要手段，目前檢測動物組織、血液中可樂定殘留的方法，主要是液相色譜-串聯質譜法(LC/MS/MS)[5-7]，該方法靈敏度較高，但檢測時間長、操作較繁瑣、檢測成高，不適用于養殖業和現場快速篩查。本研究通過制備可樂定完全抗原，免疫新西蘭大白兔產生特異性抗體，根據免疫競爭原理，采用抗原抗體特異性反應，建立了一種適用于動物尿液、組織中可樂定殘留檢測的酶聯免疫檢測試劑盒，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、檢測時間短等優點，適合基層和現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 可樂定標準品(純度≥99%)，碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(純度≥99%)，牛血清白蛋白(BSA)，卵白蛋白(OVA)，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)等均購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)購自上海雪滿生物公司；N ,N -二甲基甲酰胺(GR)等其他化學試劑購自國藥集團。

1.1.2 儀器與設備 酶標儀360T，上海科華公司；旋轉蒸發儀R-215，BuchiLabortechnik AC；高速冷凍離心機CT14RDII，上海天美；紫外分光光度儀UV-7502PC，上海欣茂儀器有限公司；WatersXevo TM TQ MS，超高效液相色譜—串聯質譜儀，配有電噴霧(ESI+)離子源(美國Waters公司)；MassLynx v4.1質譜工作站(美國Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 可樂定完全抗原的制備[8-9]在可樂定的苯環4位上引入胺基為商品化的阿可樂定(Apraclonidine)，阿可樂定和丁二酸酐?；磻纬蒀LD-COOH即接臂的可樂定半抗原，其合成過程見圖1，再經過縮合劑EDC·HCl和載體蛋偶聯成完全抗原。560 mg鹽酸阿可樂定(Apraclonidine hydrochloride)、200 mg丁二酸酐置于1 mL吡啶和3 mL苯于反瓶，加熱攪拌回流5 h，待反應完全后，減壓蒸去溶劑，固體加無水乙醇和活性炭一起攪拌，加熱回流，濾除活性炭，濾液加入氯化氫乙醇溶液冷卻形成結晶，過濾，用冷無水乙醇洗結晶，干燥得到可樂定的半抗原CLD-COOH。將10 mg CLD-COOH半抗原、8 mg NHS和10 mg EDC溶于0.5 mL DMF中(混合物A)，4 ℃攪拌過夜。次日，先將30 mg BSA(OVA)溶于3 mL 0.02 mol/L的磷酸氫二鈉溶液中，并將混合物A逐滴加入，室溫攪拌6 h。裝入透析袋，用0.01 mol/L pH7.2的PBS透析，并換液4次，得到可樂定的完全抗原CLD-BSA或CLD-OVA。

圖1 半抗原可樂定接臂合成路線Fig 1 Synthesis scheme of clonidine hapten

1.2.2 可樂定多克隆抗體的制備[10-11]體重大約2 kg的新西蘭雄性大白兔，采取背部皮下多點注射的方式進行免疫。基礎免疫時，取200 μg(0.4 mg/mL)的可樂定的完全抗原CLD-OVA溶液與等量的CFA(弗氏完全佐劑)混勻乳化，直至形成乳白色的油包水型乳濁液，然后進行注射。2周后進行加強免疫，免疫劑量為100 μg與等量的IFA(不完全佐劑)，以后每7 d加強免疫，次數為3～4次具體視情況定，取耳緣靜脈血，測血清效價，直到效價不再升高，采用頸動脈取血，離心得到血清。采用CLD-BSA免疫吸附凝膠進行親和層析純化，將得到的多克隆抗體加入一定比例的甘油，置-20 ℃保存。

1.2.3 可樂定完全抗原的包被[11-12]用50 mmol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將可樂定抗原(CLD-BSA)稀釋成系列濃度(0.5～8 μg/μL)，依次包被到96孔酶標板，每孔包被量100 μL。4 ℃孵育過夜，將孔中液體傾去，每孔加入250 μL 0.5% BSA 0.01 mol/L PBS pH7.4封閉，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，將孔中封閉液傾去，放入溫度37 ℃、相對濕度20%的烘房烘干，鋁箔包裝放存4 ℃待用。

1.2.4 樣品檢測 動物尿液直接用于檢測，如尿液渾濁，將尿液于5000 r/min離心5 min取上清液用于檢測。在每孔中加入50 μL系列濃度的可樂定標準品溶液(或樣品溶液)和50 μL稀釋后的可樂定抗體，25 ℃反應30 min；洗滌4～5次后加入100 μL稀釋后的酶標二抗，25 ℃反應30 min；洗滌4～5次后加入50 μL底物液A和50 μL底物液B，25 ℃顯色反應15 min；最后加入50 μL終止液終止反應，設定酶標儀于波長450 nm處測定吸光度值。

1.2.5 線性范圍 稱取可樂定鹽酸鹽標準品10 mg，溶于1 mL甲醇溶液中制備CLD儲備液，放在4 ℃冰箱中備用。將儲備液用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH7.2 PBS)稀釋成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL系列質量濃度，在最優抗原-酶標抗體工作濃度下，測定OD450值。各質量濃度所對應的抑制率I=B/B0×100%(B0對應0 ng/mL的OD值)，以CLD藥物濃度對數為橫坐標，抑制率為縱坐標做標準曲線。

1.2.7 抗體的特異性 可樂定試劑盒與常見的β-興奮劑類，如萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅等物質進行交叉反應，得出各種藥物的半數抑制濃度(IC50)，然后計算交叉率，交叉率=IC50(可樂定)/IC50(其他藥物)×100。

1.2.8 試劑盒的精密度和準確度 在空白豬尿樣中分別添加0.15、0.2、0.5 ng/mL的可樂定標準品，每個濃度重復3次，對3批試劑盒進行測定，計算變異系數(CV)，以及計算回收率，回收率=實際測定的濃度/添加的濃度×100%。

1.2.9 試劑盒的符合性 對已確認的陰性樣品中進行添加或不添加可樂定標準品進行測定，檢測試劑盒的假陽性和假陰性，來評估它的符合性。

2 結 果

2.1 線性范圍 以吸光值為縱坐標和質量濃度為橫坐標繪成曲線圖2，在0.1～8.1 ng/mL之間曲線呈指數形，圖3是以吸光值B/B0的百分比值為縱坐標和質量濃度的對數為橫坐標作圖，表明此試劑盒在0.1～8.1 ng/mL范圍呈良好的線性，對曲線進行線性回歸得直線方程為y=-40.01x+42.84，相關系數R2=0.9777，半數抑制濃度IC50為0.675 ng/mL。

圖2 在450nm下不同可樂定濃度吸光值Fig 2 Absorbance values of different clonidine concentration at 450nm

圖3 可樂定濃度對數吸光度百分比Fig 3 Standard curve of clonidine-Kit

2.3 抗體的特異性 可樂定試劑盒與常見的β-興奮劑類，例萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅等物質的交叉情況檢測結果見表1，表明可樂定試劑盒與β-興奮劑類無交叉反應。

表1 可樂定抗體對其他藥物的交叉反應率Tab 1 The percent cross reactivity of clonidine-Kit with beta-agonists

2.4 試劑盒的準確度和精密度 平均添加回收率及變異系數計算結果如表2所示，從表中看到可樂定藥物在豬尿中的添加回收率在81%～109%之間；在批內、批間的變異系數3.7%～9.2%之間，表明該ELISA試劑盒具有良好的準確性和精密性。

2.5 試劑盒的符合性 從試劑盒的假陰性、假陽性測定以及儀器檢測樣品比對情況，評估其符合性。

2.5.1 假陰性率 在已確認的陰性樣品中添加不同濃度的可樂定標準品，評價試劑盒的假陰性。添加6份樣本，測定結果見表3，均為陽性，未發現假陰性。

表2 準確度和精密度測定結果Tab 2 Recovery test of clonidine added to sample by clonidine-Kit

表3 可樂定的試劑盒假陰性評價結果Tab 3 False negative result of clonidine -Kit ng/mL

2.5.2 假陽性率 取20份經儀器確認的陰性尿樣，試劑盒測定結果濃度低于0.1 ng/mL的有18份，濃度低于0.2 ng/mL的有2份，結果判定均為陰性，未出現假陽性。

2.5.3 與儀器測定進行比對 取50份空白豬尿樣品，隨機添加可樂定標品，制得50份盲樣，分別采用ELISA試劑盒和液相色譜-串聯質譜進行測定，儀器方法參照文獻[10]所述進行操作。經檢測40份樣品確認為陰性，10份檢測結果大于0.2 ng/mL，判定為陽性，ELISA檢測結果與液相色譜-串聯質譜檢測結果相符，表明此試劑盒的符合性高。

3 討 論

3.1 包被抗原-可樂定抗體-酶標二抗工作濃度選擇 采用方陣試驗法對間接競爭ELISA法中包被抗原、可樂定抗體和酶標二抗的稀釋度進行篩選并確定工作濃度，工作濃度優化根據實際使用時陰性樣的檢測OD450為2.0左右原則進行調試。將HRP-羊抗兔IgG分別作1︰3000、1︰4000、1︰5000和1︰6000倍稀釋，用包被好的ELISA板測其0D值，選擇最合適酶標二抗濃度和包被濃度。通過方陣試驗得到最優濃度組合為：抗原包被濃度為1～2 μg/mL，可樂定抗體濃度為10 μg/mL，酶標二抗稀釋比1︰5000，此時的OD450值2.1左右。

3.2 試劑盒的性能 關鍵影響因素抗體的特異性和效價決定了試劑盒的性能，這兩點又和免疫抗原及免疫方式相關，本研究在不改變可樂定分子結構特征基礎上進行接臂，通過臂上基團偶聯到載體蛋白上，以避免載體蛋白(BSA或OVA)掩蔽可樂定小分子的抗原性，提高免疫效果和效價。在免疫方式上采用抗原和弗氏完全佐劑及不完全佐劑聯合應用，適當減少每次免疫劑量，采用小劑量延長免疫周期方式來提多克隆抗體的效價和特異性。

本研究建立了競爭ELISA試劑盒，經性能分析測試，證明此試劑盒具有特異性好、準確性和重復性高等特點，適用于對動物尿樣、血清和組織中的可樂定殘留快速檢測，為可樂定殘留的監控提高了靈敏高、準確性好、快速便捷的檢測方法。

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(編輯：李文平)

Development and Performance Measurement of Clonidine ELISA Test Kit

LI Dan-ni1, GU Xin1, HUANG Hua2, LU Pei-si2, WANG Xue-sheng2, HUANG Shi-xin1*

(1.Shanghai Muncipal Institute of Veterinary Drug and Feedstuff Control, Shanghai 201103, China；2.Rohi Biotechnology Co.Ltd, Shanghai 200231, China)

HUANG Shi-xin, E-mail: yure@yeah.net

An indirect competitive ELISA assay with preparing specific anti-clonidine polyclonal antibody was developed for the rapid detection of clonidine in the animal urine. The results showed that the logarithm of clonidine concentration with the absorbance percentage shows a linear relationship between 0.1～8.1 ng/mL, the correlation coefficientR2is 0.977, the half inhibitory concentration (IC50) is 0.675 ng/mL, the detection limit for the clonidine assay is 0.159 ng/mL, the sample recovery is 81%～109%, the variation coefficient is 3.7%～9.2%. This assay exhibits good specificity with no any cross reactions to β-agonists. It could be used as rapid detection for the residual clonidine in the samples such as animal urine, serum and tissues.

clonidine; competitive ELISA; polyclonal antibody; test kit

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.07

國家公益性行業(農業)科研專項(201203023)；上海市科技興農重點攻關項目[滬農科攻字(2014)第3-3號]

李丹妮，高級畜牧師，從事獸藥殘留檢測與方法開發。

黃士新。E-mail:yure@yeah.net

2017-01-28

A

1002-1280 (2017) 08-0040-06

S859.84