3株H9亞型禽流感毒株的分離鑒定和交叉攻毒保護試驗比較

蔡青秀，張園園，魏波，蔣貽海，凌紅麗

(青島蔚藍生物制品有限公司，山東青島 266114)

3株H9亞型禽流感毒株的分離鑒定和交叉攻毒保護試驗比較

蔡青秀，張園園，魏波，蔣貽海，凌紅麗*

(青島蔚藍生物制品有限公司，山東青島 266114)

為了解山東部分地區H9亞型禽流感病毒變異情況，將2015年采自濰坊、聊城、煙臺的H9N2禽流感疑似病料，進行RT-PCR擴增、測序、遺傳進化分析，并將3株分離株純化后進行了血清學和交叉攻毒保護試驗。結果顯示： 3株分離株之間的HA和NA基因同源性很高，分別為97%～97.6%和93.5%～94.4%，而與早期分離株和疫苗株的同源性較低，分別為74.9%～90.3%和86.3%～92.3%；遺傳進化分析顯示3株分離株與GenBank中近年的H9N2分離株親緣關系近，同屬Y280-like分支，而與早期分離株的親緣關系較遠。交叉攻毒保護實驗結果證明，不同地點分離的H9N2禽流感流行毒株間有較好的交叉保護力。本研究為指導禽流感疫情防控以及疫苗研制提供了依據。

H9N2亞型禽流感病毒；HA基因；NA基因；遺傳進化分析；交叉攻毒保護

禽流感是由禽流感病毒引起的禽類的一種傳染病，分為高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感引起家禽高發病率和死亡率，而低致病性禽流感則導致家禽出現呼吸道癥狀、生長發育受阻及產蛋下降等，嚴重危害養禽業的健康發展[1]。我國自1992年首次報道從雞群中分離到H9N2亞型禽流感病毒以來，目前絕大部分省市都有H9亞型禽流感的流行，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失[2-3]。

禽流感基因組為8節段的負鏈RNA，很容易發生基因突變和重排現象[4]，尤其是在免疫壓力等因素的作用下，國內外已有許多關于禽流感在家禽中不斷發生變異的報道[5-6]。H9亞型禽流感滅活疫苗的廣泛應用使得該病得到了有效控制，但是近幾年來H9亞型禽流感在免疫雞群中仍時有發生[7]，仍然是影響我國養禽業健康發展的重要疾病之一。因此，加強H9N2 AIV遺傳演化的檢測和分析十分必要。本研究通過對2015年在山東地區分離得到的3株H9N2 禽流感毒株進行序列遺傳變化的分析和交叉攻毒保護試驗，以期了解山東部分地區近年來H9N2亞型AIV的遺傳變異情況，為H9亞型禽流感的防控策略及疫苗研制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和雞胚 病料分別采自2015年山東濰坊、聊城、煙臺地區疑似禽流感病死雞的肺、氣管等組織。10日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通試驗動物技術有限公司。

1.1.2 毒株和血清 NDV陽性血清、EDSV陽性血清及SPF雞陰性血清均購自中國獸醫藥品監察所；H9亞型、H7亞型、H5亞型AIV陽性血清購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.1.3 試劑和載體 Trizol reagent、DEPC 水購于Invitrogen 公司；RT-PCR試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Takara公司；pET-32a載體為本實驗室保存；無水乙醇、異丙醇、氯仿等均為國產分析純。

1.1.4 引物設計與合成 根據GenBank上公布的禽流感H9N2的HA和NA基因序列，利用Primer 5軟件分別設計了2對擴增引物，各引物的序列用途及擴增長度詳見表1。

表1 PCR擴增所用引物Tab 1 Primers used for PCR

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 將山東不同區域采集的疑似禽流感病雞的肺、氣管等組織病料分別剪碎研磨后，按1∶5比例加入滅菌生理鹽水(內含1000 U/mL雙抗)，制成勻漿。在-20 ℃反復凍融3次，8000 r/min離心15 min，取上清，經0.22 μm濾膜無菌過濾。

1.2.2 雞胚接種 將上述3份濾液分別經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚各5枚，0.2 mL/胚，37 ℃繼續孵育。24 h內死亡雞胚棄去，觀察至96 h，無論死胚、活胚逐胚收獲尿囊液，標記后凍存。

1.2.3 血清學鑒定

1.2.3.1 紅細胞凝集試驗(HA) 按現行《中國獸藥典》附錄進行，分別測定各雞胚液對1%雞紅細胞的凝集效價。

1.2.3.2 血凝抑制試驗(HI) 將有血凝性的雞胚液用滅菌生理鹽水稀釋成4HA單位的抗原液，分別與H9亞型AIV陽性血清、NDV陽性血清、ESDV陽性血清、H5、H7亞型AIV陽性血清和SPF雞陰性血清作HI試驗。

1.2.4 分子生物學鑒定

1.2.4.1 RNA的提取和RT-PCR擴增 病毒RNA的提取參照Trizol Reagent說明書進行。所用試劑均為RNase-free，器皿均用DEPC水處理并經過高壓滅菌。RT-PCR反應根據Takara公司One-step RT-PCR試劑盒說明書進行。

1.2.4.2 HA、NA基因的TA克隆和序列分析 HA基因、NA基因全長PCR產物經核酸電泳鑒定大小正確后，利用凝膠回收試劑盒回收，回收產物分別連接pET-32a進行TA克隆，每個毒株的HA和NA基因分別選3株PCR鑒定陽性克隆株送南京金斯瑞公司測序，測序結果與GenBank中的參考序列(表2)進行同源性和遺傳進化分析。

表2 參考序列Tab 2 Reference strains

1.2.5 毒種純化與增殖 采用雞胚終點稀釋法并結合血清中和試驗方法進行：將WF株、LC株、YT株抗原液做1000倍稀釋后與等量的ND陽性血清、H5亞型AIV陽性血清(體積比為1∶1∶1)，室溫作用1小時，進一步做10倍遞進稀釋，取10-2、10-3、10-4三個稀釋度(最終稀釋度為10-5、10-6、10-7)各接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置37 ℃繼續孵育。選接種后72～120 h死亡且病痕明顯的雞胚，逐枚收獲雞胚液并測定HA效價，選擇最高稀釋度的一枚感染胚液為傳代接種物。按照上述方法將毒種純化3代。將第三代感染胚液用滅菌生理鹽水作10-4稀釋，經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚0.1 mL，選接種后72～120 h死亡且病痕明顯的雞胚，收獲雞胚液混合，定量分裝。

1.2.6 病毒含量測定 將雞胚液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9 4個稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚各5枚，0.1 mL/胚，置37 ℃繼續孵育。24 h以前死去的雞胚棄去不計，觀察至120 h，無論死胚、活胚逐胚收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價，凝集價不低于1︰16(微量法)者判為感染，按照Reed-Muench法計算EID50。

1.2.7 單因子血清的制備 取1月齡SPF雞12只，分3組，分別頸部皮下注射WF、LC、YT病毒株弗氏完全佐劑滅活疫苗0.5 mL/只，免疫后7 d、14 d采血檢測HI抗體，免疫后第14天分別免疫WF、LC、YT病毒株弗氏不完全佐劑滅活疫苗，免疫后21 d、28 d采血檢測，直至血清HI效價達9～10log2，若免疫后21 d仍未達到，則加強免疫，達到要求后，采血分離血清。

1.2.8 交叉血凝抑制試驗 在同一條件下，用4個血凝單位的病毒抗原分別交叉測定三種單因子血清對每種病毒的HI效價。HA和HI試驗參照現行《中國獸藥典》方法進行。

1.2.9 交叉免疫攻毒保護試驗

1.2.9.1 疫苗制備 將WF株、LC株及YT株分別用滅菌生理鹽水作1000倍稀釋，分別經尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，0.1 mL/胚，接種后繼續在37 ℃孵育至120 h，每8～12 h照蛋一次，棄去接種后24 h內死亡的雞胚，收獲24～120 h的死胚及120 h的活胚尿囊液，測定病毒液的血凝效價及EID50。收獲的病毒液中分別加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，置37 ℃恒溫搖床內滅活24 h。分別取3個毒種的滅活病毒抗原液，以吐溫-80及司本-80為乳化劑，白油為佐劑，分別乳化制成WF株、LC株及YT株共3個毒株的油包水型滅活疫苗，油水比為2︰1。

1.2.9.2 免疫 將60只21日齡的SPF雞分成4個組，每組15只雞，第1、2、3組為免疫組，分別經頸部皮下注射WF株、LC株及YT株滅活疫苗，0.3 mL/只，第4組為對照，不免疫。

1.2.9.3 HI效價測定 于免疫后21 d，所有試驗雞采血，對各試驗組雞分別用WF株、LC株及YT株3種HI試驗抗原進行HI效價測定。

1.2.9.4 交叉攻毒保護試驗 采血后，各試驗雞分別用禽流感H9亞型流行毒株攻擊，每組15只雞，各取5只分別攻WF毒株、LC毒株和YT毒株。攻毒劑量為100倍稀釋毒0.5 mL/只，翅靜脈注射，攻毒后第5天采集所有試驗雞的泄殖腔及咽拭子進行病毒分離，觀察不同毒株滅活疫苗對不同毒株攻擊的交叉保護情況。

2 結 果

2.1 病毒的分離培養 WF株、LC株及YT株病料分別接種5枚SPF雞胚觀察至96 h分別有2枚、3枚和2枚死亡，逐胚收獲雞胚液，標記。將收獲的雞胚液進行HA試驗，結果死亡胚都有血凝性，接種存活胚和對照組的HA效價1︰2。接種死亡胚的檢測情況詳見表3。

表3 病毒分離結果Tab 3 Results of virus isolation

2.2 HI試驗 將有血凝活性的分離物分別用滅菌生理鹽水稀釋成4HA單位的抗原液，血凝抑制試驗結果表明，分離病毒只被禽流感病毒H9亞型陽性血清特異性抑制，血凝抑制效價為27～28，不被禽流感病毒H5、H7亞型陽性血清、新城疫病毒陽性血清抑制，初步判定分離毒株是H9亞型禽流感病毒。

2.3 RT-PCR檢測和TA克隆 HA基因、NA基因PCR產物經核酸電泳鑒定大小正確后(圖1、圖2)，利用凝膠回收試劑盒回收并分別連接pET-32a進行TA克隆，每個毒株的HA、NA基因分別選3株PCR鑒定陽性克隆株送南京金斯瑞公司測序，測序結果與GenBank中H9N2禽流感毒株的參考序列進行核苷酸序列同源性比較，并用MEGA 4.0軟件繪制基因進化樹。

M. Marker DL2000; 1. WF株HA; 2. LC株HA; 3.YT株HA; 4.SPF雞胚液; 5.陽性對照M. Marker DL2000; 1. HA of WF strain; 2. HA of LC strain; 3. HA of YT strain; 4. Negative control; 5. Positive control圖1 H9N2 AIV分離株HA基因RT-PCR擴增結果Fig 1 HA genes amplified by RT-PCR of H9N2 AIV isolate strains

M. Marker DL2000; 1.WF株NA; 2.LC株NA;3.YT株NA; 4. SPF雞胚液; 5.陽性對照M. Marker DL2000; 1. NA of WF strain; 2. NA of LC strain; 3. NA of YT strain; 4. Negative control; 5. Positive control圖2 H9N2 AIV分離株NA基因RT-PCR擴增結果Fig 2 NA genes amplified by RT-PCR of H9N2 AIV isolate strains

2.4 HA基因序列分析 測序結果顯示，WF株、LC株、YT株的HA基因全長大小相同，都為1683 bp，其與GenBank中H9N2參考序列進行比對發現，本研究中分離到的WF株、LC株、YT株之間核苷酸同源性為97%～97.6%，推導的氨基酸同源性為97.8%～98.2%；與GenBank中早期分離株(HongKongY439、HongKong Y280)、經典疫苗株(Shandong/6/96、Shanghai/F/98)的同源性較低，為74.9%～90.3%，推導的氨基酸序列為80.0%～91.7%。與GenBank上發表的2009～2015年的H9亞型禽流感毒株的同源性較高，高達92.1%～98.9%，推導的氨基酸序列同源性為93.5%～98.6%。遺傳進化分析結果與同源性分析結果一致，近年分離株和早期分離株明顯分為不同簇，而本研究中的3個分離株與近年分離株的親緣關系最近，屬于Y280-like分支(圖3)。

2.5 NA基因序列分析 測序結果顯示，WF株、LC株、YT株的NA基因全長大小相同，都為1401 bp，其與GenBank中H9N2參考序列進行比對發現，本研究中3個分離株之間核苷酸同源性為93.5%～94.4%，推導的氨基酸同源性為94.6%～95.3%；與GenBank中早期分離株(HongKongY439、HongKong Y280)、經典疫苗株(Shandong/6/96、Shanghai/F/98)的同源性較低，為86.3%～92.3%，推導的氨基酸序列為87.1%～93.7%。與GenBank上發表的2009～2015年的H9亞型禽流感毒株的同源性較高，高達94.2%～99.2%，推導的氨基酸序列同源性為95.3%～99.6%。遺傳進化分析結果與同源性分析結果一致，近年分離株和早期分離株明顯位于不同簇，而本研究中的3個分離株與近年分離株的親緣關系最近，同屬Y280-like分支(圖4)。

2.6 毒種純化與增殖 采用雞胚終點稀釋法并結合血清中和試驗方法將WF株、LC株和YT株毒種連傳三代進行了純化，選擇三代時最高稀釋度的一枚感染胚液作為毒種進行病毒繁殖。

2.7 病毒含量 經測定，WF株、LC株、YT株毒種病毒含量分別為108.17、107.83和107.68EID50/0.1mL。

圖3 HA基因全長遺傳進化樹分析Fig 3 Phylogenetic tree based on complete HA genes

圖4 NA基因全長遺傳進化樹分析Fig 4 Phylogenetic tree based on complete NA genes

2.8 HI抗體測定 不同地點分離的3株禽流感H9亞型流行毒株所制備出的3種滅活疫苗免疫SPF雞21 d后，分別用同樣3株抗原進行HI抗體效價檢測，結果WF株、LC株和YT株制備的疫苗HI效價分別為8.8～10.0log2、9.4～9.8log2和6.0～10.4log2(表4)，可見同一滅活苗免疫組雞的血清樣品采用不同毒株作為抗原進行測定，其HI抗體效價幾何平均值存在較大差異，差異范圍為0.2～4.4log2，用同源毒株作為抗原測定免疫組雞的血清樣品，可獲得較高的HI抗體效價。

2.9 流行毒株間的交叉攻毒保護試驗 結果顯示

攻毒對照組均5/5分毒陽性，對照成立。不同區域分離的WF株和YT株制備的疫苗對WF株和YT株交叉攻毒均能達到100%(5/5)保護；但對LC株攻毒均為80%(4/5)保護；LC株制備的疫苗用3種不同毒株攻毒均能達到100%(5/5)保護(表5)。

表4 3個不同毒株滅活疫苗免疫后用不同抗原進行HI試驗的結果Tab 4 HI test results based on three strains of three different inactivated vaccines

表5 流行毒株間的交叉攻毒保護試驗Tab 5 Cross-immunity protection among epidemic isolates

3 討 論

H9N2亞型禽流感在國內的發生最早可追溯到1994年[8]，直到1998年下半年至1999年上半年，在山東省大面積爆發該病[9]。目前該病在中國多省地區廣泛存在，不僅是嚴重危害中國養禽業的主要疾病之一，而且還危害到人類的健康。1998年大面積推廣應用針對疫情的H9N2亞型禽流感疫苗，對控制疫情的流行發揮了重要作用，BJ94-like類型的毒株在臨床上的分毒率明顯下降[10]。但Y280-like亞群禽流感毒株逐漸增多，在國內養殖場廣泛流行，免疫失敗的比例逐年增加，在2010年達到高峰，系統進化樹發現，該類型的毒株目前已經成為優勢流行株[11]。婁本紅等[12]在雞胚上研究了H9N2亞型禽流感的HA基因在抗體選擇壓力下的變異，結果顯示某些非優勢毒株的HA基因在抗體免疫選擇壓力下發生了抗原性變化，抗原表位變異后能抵抗特異性抗體的中和作用進而由非優勢毒株演變為優勢毒株。本研究中分離得到的三株禽流感毒株屬于Y280-like這一簇，與目前H9N2 AIV經典疫苗株SH/F/98、SD/6/96的同源性低，親緣關系較遠，而與近年流行株的親緣關系密切。因此，疫苗株與流行株之間的抗原差異可能是導致近年來H9亞型禽流感免疫保護效果不好的重要原因之一。

本研究中的WF株、LC株和YT分離株與不同地域分離株進行遺傳進化分析顯示，本研究中的3株山東分離株和國內不同地域分離的H9N2亞型禽流感毒株并沒有表現出特殊的地域偏好性，與地理位置上相隔較遠的廣東、廣西、上海、浙江等地的近年分離株的同源性亦較高。提示包括山東省在內的全國H9N2亞型禽流感的HA和NA基因可能處在一個比較穩定的遺傳演化過程[13]，而病毒是通過候鳥或者運輸發生傳播是值得研究的一個問題，明確病毒的傳播途徑和方式對禽流感的防控具有重要意義。

本研究采用2015年在山東分離的3株H9亞型禽流感病毒流行毒株，分別制備滅活疫苗，免疫SPF雞，免疫后21 d，采血測定HI效價，然后分別用上述3株毒株進行攻擊，觀察不同區域分離的H9亞型流行毒株的交叉免疫攻毒保護效果，結果顯示，用不同地點分離的這3株H9N2 AIV流行毒株所制備出的3種滅活疫苗免疫SPF雞21 d后，HI抗體效價均明顯上升，達到6.0～10.4log2；這3種滅活疫苗所誘導產生的HI抗體效價存在一定的差異，差異范圍為0.2～4.4log2，用同源毒株作為抗原測定免疫雞的血清樣品可獲得較高的HI抗體效價。每個疫苗免疫組分別用WF株、LC株、YT株進行攻毒后，對照雞均100%分毒陽性，3種滅活疫苗對這3株流行毒株攻毒的保護率80%～100%(4/5～5/5)。結果證明了本研究中這3個不同地點分離的H9N2 AIV流行毒株相互間有較好的交叉保護力，這也與序列分析結果顯示3株流行毒株的親緣關系較近相一致。

當前H9N2亞型禽流感病毒在中國很多地區流行，又因為禽流感病毒是分節段的單股負鏈RNA病毒，同一毒株在復制的過程中以及不同毒株之間很可能發生基因突變和基因重組，所以加強對H9N2亞型禽流感病毒的生物學特性和分子流行病學研究，對于家禽養殖和公共衛生安全方面具有重要的現實意義。本研究通過對3株不同地點分離的H9N2 AIV毒株進行了HA、NA基因的遺傳進化分析和生物學特性分析，為了解山東省H9N2 AIV的流行變異情況和疫苗研制提供了依據。

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(編輯：李文平)

Isolation and Identification of Three H9 Subtype Avian Influenza Virus and Cross-immunity Protection Comparison

CAI Qing-xiu, ZHANG Yuan-yuan, WEI Bo, JIANG Yi-hai, LING Hong-li*

(Qingdao Vland Biological Products Co., Ltd, Shandong 266114, China)

LING Hong-li, E-mail：linghl@vlandgroup.com

To explore the genetic mutations of H9 subtype avian influenza virus in Shandong province, tissues suspected of being infected with AIV H9 subtype from Weifang, Liaocheng and Yantai were collected in 2015. They were detected by RT-PCR method. After sequencing, genetic evolution was analyzed and cross-immunity protection was carried out. The results show that the isolates have high homologies with H9N2 strains of recent years up to 97%～97.6% and 93.5%～94.4% respectively, while shared low homologies with H9N2 strains of early years and vaccine strains, 74.9%～90.3 and 86.3%～92.3% respectively. Genetic evolution analysis results show that the three strains belonged to genetic Y280-like sublineage. There was a good cross protection force among the three H9 subtype isolates from different places. This study has provided guidance for the avain influenza epidemic prevention and control, and also a basis for the research and development of vaccine.

H9N2 subtype avian influenza virus; HA gene; NA gene; genetic evolution analysis; cross challenged test

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.02

國家國際科技合作專項(2014DFA31830)

蔡青秀，碩士，從事動物疫苗的研發。

凌紅麗。E-mail：linghl@vlandgroup.com

2017-03-08

A

1002-1280 (2017) 08-0006-08

S852.65