分散固相萃取法結合液相色譜串聯質譜法檢測雞可食性組織中泰萬菌素及3-乙酰泰樂菌素殘留量

吳劍平，張婧，李丹妮，嚴鳳，潘娟

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

分散固相萃取法結合液相色譜串聯質譜法檢測雞可食性組織中泰萬菌素及3-乙酰泰樂菌素殘留量

吳劍平，張婧，李丹妮*，嚴鳳，潘娟

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

建立了檢測雞肉、雞皮脂、雞肝和雞蛋中泰萬菌素以及其主要代謝產物3-乙酰泰樂菌素殘留量的液相色譜串聯質譜方法。前處理使用分散固相萃取法，選擇使用50%(V/V)乙腈提取，無水MgSO4進行脫水和鹽析，正己烷脫脂，酸性氧化鋁粉末進行樣品凈化。將離心后的上清液以如下方法進行上機檢測：使用反相色譜柱進行分離，流動相為0.1%甲酸和乙腈，采用梯度程序進行洗脫，三重四級桿質譜進行定性定量分析。實驗結果表明，方法的最低檢出限為2.5 μg/kg，最低定量限為5 μg/kg，在5～200 μg/kg范圍內線性關系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%，RSD<20%，表明該方法具有較好的準確度與精密度。

泰萬菌素;3-乙酰泰樂菌素; 分散固相萃取; 串聯質譜法

泰萬菌素(Tylvalosin)是新一代的大環內酯類抗生素[1]，常作為酒石酸鹽使用，即酒石酸泰萬菌素(Tylvalosin Tartrate)。該產品在2007年之前曾用名是酒石酸乙酰異戊酰泰樂菌素(Acetylsivaleryltylosin Tartrate，簡稱AIV)。泰萬菌素是一種畜禽專用的抗生素，通過抑制細菌蛋白質的合成從而抑制細菌的繁殖，其在中國已被注冊批準用于治療豬、雞支原體感染和豬赤痢螺旋體以及其他敏感細菌的感染，其批準用藥劑量為每1 L水添加200 mg(有效成分)，連用3～5 d；酒石酸泰萬菌素預混劑的批準用藥劑量為每1000 kg飼料添加100～300 g(有效成分)，連用7 d[2]。泰萬菌素可在動物體內經代謝后以原藥和3-乙酰泰樂菌素(3-O-Acetyltylosin，簡稱3-AT)的形式殘留在肝臟和皮脂中[3]。歐盟對泰萬菌素的使用有嚴格規定[4]，泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素在雞皮/脂肪、雞肝和雞蛋中的最大殘留限量(MRL)之和不得超過50 μg/kg，兩者的MRL分別不得超過25 μg/kg。泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素基本化學結構見圖1。

固相萃取技術已被廣泛應用于各種殘留檢測領域，其具有簡便快捷、特異性好等特點。據文獻報道[5-8]，常用的固相萃取主要有分散固相萃取和填料柱固相萃取這兩種方式，通過這些手段可以達到去除試樣中的干擾物質，使痕量組分得到富集，便于檢測和分離，保護色譜分析柱等目的。相比傳統填料柱固相萃取，分散固相萃取具有節省人力和時間，提高前處理穩定性和降低耗材成本的優勢。

泰萬菌素Tylvalosin

3-乙酰泰樂菌素3-O-Acetyltylosin圖1 泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素基本化學結構圖Fig 1 Structure of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、串聯四極桿質譜帶HESI電離噴霧源(TSQ Quantiva)、Xcalibur數據處理系統、高速冷凍離心機(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；減壓旋轉蒸發儀(B-490，BUCHI)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 C18分析柱(Thermo Accucore RP-MS 100 mm×2.1 mm， 2.6 μm)，泰萬菌素對照品(英國伊科拜克，批號：130503，93.69%)，3-乙酰泰樂菌素對照品(英國伊科拜克，批號：Q3317，96.54%)，無水硫酸鎂(分析純)，氯化鈉(分析純)，正己烷(色譜純)，乙腈(色譜純)，酸性氧化鋁(100～200目)，乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)；去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%)。

1.3 色譜條件 色譜柱：Thermo Accucore RP-MS 100 mm×2.1 mm，2.6 μm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL，流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈，采用梯度洗脫程序如表1所示，所得特征離子質量色譜圖如圖2。從上至下通道依次為泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1.4 質譜條件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串聯四極桿質譜帶HESI電離噴霧源質譜檢測器對1 μg/mL的泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素單標溶液進行優化，兼顧各目標化合物優化后的質譜條件為：選擇正離子模式，源電壓3900 V，鞘氣(Sheath gas)壓力344 kPa，輔助氣(Aux gas)流速5 L/min，吹掃氣(Sweep gas)流速0.3 L/min，離子傳輸管(Ion transfer tube)溫度 350 ℃，霧化器(Vapourizer)溫度350 ℃，檢測模式為選擇反應監控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞氣壓力0.2 Pa，Q1段分辨率設為半峰寬0.7，Q2段分辨率設為半峰寬0.7，泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素的定性與定量離子對以及對應的撞擊能量見表2。

圖2 1 ng/mL混合對照品溶液SRM圖Fig 2 SRM chromatography of 1 ng/mL mixed standard solution

化合物Compound定性離子對Qualitativeionpair(m/z)定量離子對Quantitativeionpair(m/z)透鏡電壓Lensvoltage/V碰撞能量Collisionenergy/eV泰萬菌素Tylvalosin1042.60>109.061042.60>174.131042.60>109.0618548453-乙酰泰樂菌素3-O-Acetyltylosin958.52>174.11958.52>814.40958.52>174.111814432

1.5 樣品前處理 取2.00 g樣品置于50 mL試管中，加入50%乙腈溶液10 mL，渦旋混勻后加入10.00 mL正己烷和無水硫酸鎂與氯化鈉各2 g，振蕩提取10 min，8000 r/min離心5 min，用注射器準確吸取中間乙腈層清液1.00 mL至離心管中備用。準確移取0.50 mL備用液，加入0.50 mL 20 mM酒石酸溶液和0.20 g酸性氧化鋁粉末，渦旋均勻后12000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜后，裝入棕色進樣瓶上機測定。

2 結果與分析

2.1 線性定量范圍 將泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素對照品分別用甲醇溶解制成1 μg/mL的標準品貯備液，取適量該貯備液用20 mM酒石酸溶液稀釋成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L的標準曲線系列工作溶液，將該系列溶液依次按1.4項和1.5項的檢測方法進樣檢測，將所得定量通道色譜圖積分后，面積與內標峰面積比值以Y表示，進樣濃度以X表示，所得回歸曲線結果如下表3所示，其線性相關系數r都大于等于0.995。實驗表明，該方法同時檢測泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素進樣濃度在0.5 μg/kg～20 μg/L，即實際含量在5～200 μg/kg范圍內線性良好。

表3 泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素標準曲線Tab 3 Standard curve of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

2.2 方法靈敏度 分別取雞肉、雞皮/脂、雞肝和雞蛋進行實驗，空白試料按1.3～1.5項相同的步驟處理后，進行測定。測定結果表明：在相應的保留時間，空白試料對所測藥物無干擾。定量限(LOQ)：添加適量的1 μg/mL的混合標準溶液于2 g空白試樣中，按1.3～1.5項操作步驟處理后上機測定，所得特征離子質量色譜圖見圖3，依據信噪比S/N>10(按PtP算)，確定泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素的最低定量限為5 μg/kg，最低檢測限為2.5 μg/kg。

(a)空白雞肉添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank muscle;(b)空白雞皮/脂肪添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank skin/fat;(c)空白雞肝添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank liver;(d)空白雞蛋添加5 μg/kg 5 μg/kg added in blank egg圖3 泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素實際添加實驗特征離子質量色譜圖Fig 3 Typical SRM chromatogram of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in tissues

2.3 方法準確度與精密度 采用標準添加法，在雞皮、雞肉、雞肝和雞蛋中添加4個不同濃度(定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個濃度)的泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素進行回收率試驗，各濃度進行3個批間樣品平行試驗，批內重復5次，求批內、批間相對標準偏差，計算結果見表4～表7。從表中試驗結果可以看出，本方法在空白雞皮、雞肉、雞肝和雞蛋中進行5～50 μg/kg的添加濃度，方法的回收率均在60%～120%之間，批內、批間相對標準偏差均小于20%。

2.4 方法選擇性的驗證 選擇空白雞皮、雞肉、雞肝和雞蛋各20個空白樣品，按優化條件進行處理后上機測定，未發現有假陽性結果，表明該方法的選擇性良好。

表4 雞皮中泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 4 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken skin/fat(n=5)

表5 雞肉中泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 5 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken muscle(n=5)

表6 雞肝中泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 6 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken liver(n=5)

續表

表7 雞蛋中泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 7 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken egg(n=5)

續表

3 討論與小結

3.1 提取液提取效率研究 試料中的殘留藥物嘗試了多種提取液，包括純乙腈、50%乙腈、正己烷、異辛烷。2 g空白試樣中加入100 ng/mL的泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素標準工作液250 μL分別加入上述提取液進行振蕩提取，之后采用1.5項中前處理條件進行凈化，測得結果如表8所示，測試結果表明兩種藥物極性偏大，在50%乙腈溶液中的提取效率接近90%，在正己烷或異辛烷這類極性小的溶劑中幾乎不溶，因此選擇50%乙腈進行提取，正己烷進行脫脂。無水硫酸鎂鹽析除去雜質蛋白，取適量中間乙腈層提取液，用20 mM酒石酸稀釋后，再用酸性氧化鋁除去剩余脂肪與蛋白后，進液相色譜-串聯質譜法檢測，用外標法定量。

表8 泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素提取效率研究Tab 8 Research on extraction rate of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

3.2 分散相基質的選擇 雞肉和雞蛋中的干擾雜質主要以蛋白質和磷脂為主，主要通過無水硫酸鎂和氯化鈉進行鹽析，其對基質中的血細胞之類的生物雜質也有一定的破壞和沉降能力。乙腈在提取的同時也具有破壞蛋白質結構造成沉淀的作用。皮脂和肝臟中不但有蛋白質，還有大量的脂肪會干擾后續的檢測，原本嘗試使用C18粉末吸附，結果發現在吸附脂肪的同時，會造成提取效率的大幅下降，推測是C18粉對目標化合物也有較強的吸附能力，因為在3.1項實驗發現正己烷中泰萬菌素和3-乙酰泰樂菌素溶解性都很小，而脂肪在其中的溶解度較高，因此采用正己烷脫脂。最后，通過高速離心可以將蛋白、磷脂、血細胞等沉降至下層，未溶解的脂肪粒會漂浮在正己烷層的表面，只要吸取中間的乙腈層即可獲得富含目標物的提取液。

3.3 色譜條件的選擇 通過選擇具有更好保留性和選擇性的色譜條件可以使目標化合物獲得充分的保留與分離，本方法的目標化合物屬于中弱極性，因此選擇反相色譜柱進行分離較為合適，比較了Thermo公司裝填的兩款反相色譜柱：Accucore RP-MS 150×2.1 mm 2.6 μm和Syncronis C18 150×2.1 mm 3.0 μm。實驗結果表明，使用Accucore RP-MS色譜柱的目標物峰普遍具有保留時間不足、峰型對稱性不高的特點，推測其原因為所使用的聚合物性質填料含碳量接近10%，雖然通過殼層技術增加了填料的比表面積，但并不能提供很好的保留；Syncronis C18色譜柱的硅膠鍵合填料含碳量接近17%，為目標化合物提供了足夠的保留。流動相條件也進行了新的嘗試，原本歐盟方法所使用的流動相為：水相采用0.3%甲酸-乙酸銨溶液，有機相為0.3%甲酸甲醇溶液，經試驗發現該流動相在進行梯度洗脫條件時會造成較高的色譜柱反壓，容易發生質譜儀毛細管噴針處的結晶析出造成堵塞或液流不穩定。因此，將流動相條件改為使用水相為0.1%甲酸，有機相改為乙腈溶液，在梯度條件下柱壓變化明顯減小，毛細管噴針也不易發生堵塞，所獲得的保留時間與峰型也可以滿足檢測要求。

本研究建立了檢測雞肉、雞皮脂、雞肝和雞蛋中泰萬菌素與3-乙酰泰樂菌素殘留量的液相色譜串聯質譜檢測方法。前處理使用分散固相萃取法，液相部分使用反相色譜柱進行分離，三重四級桿質譜進行定性定量分析。實驗結果表明，方法的最低檢出限為2.5 μg/kg，最低定量限為5 μg/kg，在5～200 μg/kg范圍內線性關系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%之間，RSD<20%，表明該方法具有較好的靈敏度、準確度與精密度。

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(編輯：侯向輝)

Determination of Aivlosin and 3-Acetyl Tylosin in Edible Chicken Tissues by Dispersive Solid Phase Extraction Combined with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Jian-ping, ZHANG Jing, LI Dan-ni*, YAN Feng, PAN Juan

(Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstaff, Shanghai 201103, China)

Li Dan-ni, E-mail: yure@sina.com

To determine residue of tylvalosin (TLV) and 3-acetyl tylosin (3-AT) in edible chicken tissues such as muscle, skin/fat, liver and egg, a dispersive solid phase extraction method was used to process the sample. The 50%(V/V) acetonitrile was chosen to extract the target compounds, the anhydrous magnesium sulfate was chosen to dehydrate and salt out, the n-hexane was chosen to degrease and the acid alumina powder were chosen to purify the sample. After centrifugation, the extract was determined by the method below. The targets was separated by the gradient elution with a reverse phase column as the stationary phase and 0.1% formic acid with acetonitrile as the mobile phase. The qualification and quantification were achieved by a tandem mass spectrometry. The results showed that the LOD of the method was 2.5 μg/kg and the LOQ was 5 μg/kg. The linearity of the method was good in the range of 5～200 μg/kg and the liner correlations were all above 0.995, and the recovery of 7 targets were between 60% and 110%, and theRSDwere lower than 20%, which showed the good accuracy and precision of the method.

tylvalosin; 3-acetyl tylosin; dispersive solid phase extraction; tandem mass spectrometry

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.06

2017年農業行業標準制定和修訂項目；上海市市級農口系統青年人才成長計劃(滬農青字(2016)第2-5號)

吳劍平，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析與研究。

李丹妮。E-mail: yure@sina.com

2017-01-13

A

1002-1280 (2017) 08-0030-10

S859.84