食品中菌落總數測定不確定度評定的應用

朱勇

榮昌區疾病預防控制中心，重慶 402460

食品中菌落總數測定不確定度評定的應用

朱勇

榮昌區疾病預防控制中心，重慶 402460

目的 分析食品中菌落總數檢測結果的不確定度的來源，減少實驗誤差，提高檢測結果的準確性。方法 依據JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》、GB/T4789.2-2010食品微生物學檢驗《菌落總數測定》和《2015國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊》（菌落總數標準操作程序）分析影響菌落總數檢測結果的幾個因素從而探討不確定度的評定方法。結果建立了簡便的食品中菌落總數測定不確定度評定方法。結論 影響菌落總數檢測結果的不確定度的因素有9種，稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度、加樣體積的相對標準不確定度、平板上菌落數的相對標準不確定度3個不確定分量是評定菌落總數檢測結果不確定度是必須計算的分量，不同實驗室可根據自身情況對菌落總數檢測結果不確定度進行評定時引入其他6種因素引起的不確定度。

食品；菌落總數；不確定度

菌落總數是微生物檢驗中常見的指標，反映食品在生產過程中是否符合衛生要求。測量不確定度是表征合理地賦予被測量的分散性，是目前國際公認的用來評價檢測結果質量的參數。一切結果都具有不確定度，因此菌落總數的檢測結果也具有不確定度。近年來，理化檢測結果不確定度的評定較為統一規范，而微生物檢測結果不確定度的評定尚無成熟規范的方法，不少文獻提出，對同一樣品重復測量多次，計算菌落總數測量結果的算術平均值及標準差，從而計算測量結果的不確定度，這是不符合實際工作的。該文以榮昌區2015年一組食品風險監測項目熟肉制品的菌落總數為例，依據JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[1]GB/T4789.2-2010《菌落總數測定》[2]和《2015國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊》（菌落總數標準操作程序）[3]建立食品中菌落總數檢測結果的不確定度的評定方法，并探討其各種不確定度分量。

1 資料與方法

1.1 材料

重慶市榮昌區2015年食品風險監測項目熟肉制品菌落總數檢測結果數據一組。

1.2 儀器設備與試劑

TP-202型天平；Therm-IGS180型電熱恒溫生化培養箱；SW-CJ型超凈工作臺；LMQ.C型高溫蒸汽滅菌鍋；YH-4001型拍擊式均質器。平板計數瓊脂（批號:150211）。

1.3 檢測過程

依據中華人民共和國國家標準GB/T4789.2-2010《菌落總數測定》和《2015國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊》（菌落總數標準操作程序）用平板培養和菌落計數的方法。以無菌操作稱取檢樣25 g放入均質袋內，加入225 mL滅菌生理鹽水，用拍擊式均質器拍打2 min，制成1:10的均勻稀釋液備用，根據對樣品污染度的估計，選擇了3個連續稀釋度（擬為等于或者大于1的整數），接種平板計數瓊脂，每個稀釋度接種兩個平皿各1 mL同時取生理鹽水做1份空白對照，將冷卻至46℃的平板計數瓊脂傾注到平皿內，輕輕轉動混勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置37℃培養48 h，計數各菌落總數，測量菌落總數時，選定平板上菌落數為30～300 CFU或者接近30～300 CFU的稀釋度來計算和報告檢測結果，最后取選定稀釋度的兩個平板上的菌落數平均值乘以稀釋倍數10n作為該試樣的單位（體積）菌落數。

2 建立數學模型

2.1 菌落總數測量的計算

假設Y為樣品單位體積的菌落總數；F為樣品稀釋倍數(10的若干指數倍)；N為培養基平板的菌落計算結果；V為平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積（即樣品經10倍系列稀釋所得的樣品和生理鹽水的混合液），則該試樣單位（體積）的菌落數Y可由下式算出：

2.2 不確定度的主要來源與確認

通過該理論公式①，若以相對標準不確定度來表示各種不確定度，則菌落數Y的相對不確定度Urel(Y)可由下式算出：

式②中：Urel(F)—稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度；Urel(V)—加樣體積引入的相對標準不確定度;Urel(N)—平板上菌落數引入的相對標準不確定度。

3 試樣中菌落總數測量的相對標準不確定度分量的計算

由理論公式②可知菌落總數測量的的數學評估模型中3個不確定度分量相互獨立，為方便不確定度運算，下面均以相對標準不確定度來表示各相應的不確定度。

3.1 取樣稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(F)

不確定度分量有3個:①稱重時天平引入的相對標準不確定度Urel(M)；②實驗室溫度效應引入的相對不確定度Urel(T)；③量筒及玻璃吸管自身校準引入的相對標準不確定度Urel(C)。相對不確定度分量Urel(M)、Urel(T)和Urel(C)分析如下。

3.1.1 試樣在稱重時天平引入的相對標準不確定度urel(M)試樣稱量，使用天平稱取樣品時，根據JJG98-2006《非自動天平鑒定規程》[4]規定，0.01 g精密度天平稱量最大允守候差為±0.01 g，該實驗中均取樣25.00 g，天平線性MPE為矩形分布，該不確定度需計算兩次，一次為皮重，一次為總重。通過計算得到由天平最大允許誤差引入的相對標準不確定度：

3.1.2 稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(C)本試驗中使用250 mL的量筒，10 mL和1 mL的玻璃吸管，計數的平皿稀釋度為10-n檢測時溫度為15℃，因此不確定度主要由250 mL的量筒和10 mL、1 mL的玻璃吸管的容量允差和溫度偏離引起的溶液和容器漲縮引起。根據JJG196-2006《常規玻璃器鑒定規程》[5]，250 mL的量入式量筒最大允許誤差為±1.0 mL，10 mL玻璃吸管最大允許誤差為±0.1 mL，1 mL玻璃吸管最大允許誤差為±0.015 mL,允差為矩形分布，由此產生相對標準不確定度為：

實驗室溫度效應引入的相對不確定度Urel(T)

由10 mL的玻璃吸管引入的不確定度：

由1 mL的玻璃吸管引入的不確定度：

按照計數的平皿稀釋度10n的不同,上述不確定度分量合成Urel(F)不同，得下式:

3.2 加樣體積引入的相對標準不確定度urel(V)

由于每個計數平板所加的樣品稀釋液體積均為1 mL玻璃吸管,與上述稀釋過程中1 mL的玻璃吸管相同，因此加樣體積的相對標準不確定度Urel(V)=urel(C3)，根據稀釋倍數10n不同，即可算出Urel(V)2=0.931%×n。

3.3 平板上菌落數引入的相對標準不確定度Urel(N)

培養基計數平板上所查計的菌落總數均值是2個1mL所加試樣(稀釋勻液)中細菌經過分別培養出來的菌落總數均值。在一系列充分混勻的等量的粒子懸液(1 mL試樣稀釋均勻液)中粒子(細菌)數的隨機性服從泊松分布(Poisson scatter)，所以菌落總數(均值)在培養基平板上的隨機誤差的不確定度可用泊松分布來表示，根據《GB/T4789.2-2010菌落總數測定》菌落總數的計算方法的不同，該相對標準不確定度計數方法也不同，分為下面兩種情況：

當只選定一個稀釋度的平行檢測的兩個計數平板上的菌落數的檢測結果為Nm、Nm+1時，菌落總數的均值

則泊松分布引起的相對標準不確定度

當有兩個連續稀釋度的平板菌落數在30～300 CFU之間時，假設實驗室試樣單位體積的培養基平板菌落第一稀釋度（低稀釋度）兩個平行測定計算結果為Nm、Nm+1，第二稀釋度（高稀釋度）兩個平行測定計算結果為Nm+2、Nm+3，計算連續稀釋度所產生的相對標準不確定度Urel(N)以第一稀釋度（低稀釋度）計算結果為準，那么相當于第一稀釋度的菌落總數的均值，

表1 重慶市榮昌區2015年食品風險監測項目熟肉制品菌落總數檢測結果不確定度評定分析

則泊松分布引起的相對標準不確定度

3.4 菌落數檢測結果合成相對標準不確定度Urel(Y)和合成標準不確定度UY

因此，按照操作人員對樣品污染狀況的估計，選擇適宜n個適宜稀釋度樣品勻液進行10倍遞增稀釋中n值得不同和菌落總數的計算方法的不同，試樣中菌落總數測量的相對標準不確定度分量合成情況也不同

3.5 菌落數檢測結果擴展標準不確定度U

當p=95%時，包含因子k=2，則擴展不確定度U=2×UY。

4 不確定度的報告

報告菌落總數檢測結果時，應同時附上擴展標準不確定度U和包含因子K。例樣品1菌落總數均值N為237 CFU,菌落計數稀釋度為102,擴展標準不確定度U為80，則菌落總數檢測結果報告為（2.4±0.8）×104CFU,包含因子K=2。

5 評定不確定度過程的討論

5.1 當樣品為液體時不確定度的評定

當樣品為液體時，按照GB/T4789.2-2010《菌落總數測定》則用吸管吸取檢樣25 mL，因此在計算不確定度時，應將稱重時天平引入的相對標準不確定度Urel(M)應轉換成25 mL的玻璃吸管引入的相對標準不確定度。

5.2 其他不確定度分量

上述的取樣稀釋樣品溶液引入的相對標準不確定度Urel(F)、加樣體積的相對標準不確定度Urel(V)和平板上菌落數的相對標準不確定度Urel(N)是根據建立的數學模型理論公式①得來，在實際測量過程中，影響菌落總數的檢測結果不確定度除了上述3個因素之外，還包括以下幾種因素引起的不確定度：①檢測人員計數產生的相對標準不確定度Urel(P)；②計數平板上菌落的重疊引入的相對標準不確定度Urel(O)；③培養基的菌落生長率引入的相對標準不確定度Urel(S)；④試樣的不穩定引入的相對標準不確定度Urel(E)；⑤數字修約引入的不確定度Urel(R)；⑥培養條件產生的相對標準不確定度Urel(H)。則菌落數Y的完全相對不確定度Urel(Y)計算完全公式應該為：Urel(Y)2=Urel(F)2+Urel(N)2+Urel(V)2+Urel(P)2+Urel(O)2+Urel(S)2+Urel(E)2+Urel(R)2+Urel(H)2。各實驗室可以根據自身情況對菌落總數檢測結果不確定度評定的時候引入以下幾種因素引起的不確定度使不確定度評定更加準確。

5.2.1 檢測人員計數產生的相對標準不確定度Urel(P)檢測人員在計數培養基平板上的菌落時，因經驗和計數平板上菌落的復雜培養結果等而出現隨機誤差和識別誤差，該誤差通過對同一個培養基平板的菌落進行多次重復計數后統計得出，可以采用貝塞爾公示進行計算出相對標準不確定度。該文暫忽略了該不確定度。

5.2.2 計數平板上菌落的重疊引入的相對標準不確定度Urel(O)計數平板上菌落的重疊不確定度隨菌落在平板上的覆蓋面積不同而異。如平板上的菌落覆蓋面積為5%、10%、15%、20%、時，對應相對標準不確定度Urel(O)則分別為 0.02、0.04、0.06、0.08[6]。 其值不易判定，所以該文忽略了該不確定度

5.2.3 培養基的菌落生長率引入的相對標準不確定度Urel(S) 該實驗培養基為非選擇培養基，實驗室配制或商品化的成品培養基的質量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響菌落生長率，產生不確定度。因此所有配制好的培養基均應進行質量控制試驗，通過與確認合格培養基進行比對，從而計算出不確定度。該文也暫時忽略了該不確定度

5.2.4 試樣的不穩定引入的相對標準不確定度Urel(E)樣品在受理之后測量之前，受試樣特性、細菌本身特性和樣品存儲運輸條件的的影響，細菌會發生數量變化，即引入不確定度。通常情況下，此類相對標準不確定度不易計算，可以通過對試樣進行保鮮存儲運輸，減少儲存時間等方式來消除該不確定度。該文暫時忽略了該不確定度

5.2.5 數字修約引入的標準不確定度Urel(R) 按照國家標準GB/T4789.2-2010《菌落總數測定》檢測結果采用兩位有效數字當菌落數大于或等于100 CFU時，用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約，如Y.X×10nCFU（Y≥1，X≥0，n≥2），其修約間隔為 0.1×10nCFU；菌落數小于100 CFU時，其修約間隔為1 CFU。其修約間隔引起的不確定度為均勻分布[6]，由此產生的標準不確定度分別為由于數值均很小，該文忽略了該不確定度。

5.2.6 培養條件產生的相對標準不確定度Urel(H) 培養條件中，溫濕度等環境因素也會影響菌落的生長，因此可以通過控制環境因素來消除該不確定度，由于該不確定度不易計算，該文暫時忽略了該不確定度。

5.2.7 正確建立數學模型是評定菌落總數檢測結果不確定的基礎 菌落總數測量結果是由文中理論公式①換算而來，相應的菌落測量結果的不確定度與樣品稀釋倍數、培養基平板的菌落計算結果、平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積3個變量不確定度有關，故湯水平等[6]、劉麗花等[7]、陳建琳等[8]、范媛媛等[9]在評定菌落總數檢測結果不確定度時建立數學模型為y=x是不合理的，沒有考慮樣品稀釋倍數和平行檢測平板中所加樣品的稀釋液的體積對檢測結果的影響，因此不確定度也不能正確的評定。

5.2.8 關于多次測量同一樣品而評定不確定度 湯水平等[8]、劉麗花等[9]、陳建琳等[10]、范媛媛等[11]、汪艷玲等[12]提出對同一樣品重復測量10次或者20次，然后計算菌落總數測量結果的算術平均值及標準差或者對數平均值及其標準差來計算測量結果的不確定度。在實際檢測工作中微生物檢測樣品通常不穩定，存在動態污染變化等問題，這種多次重復檢測浪費檢測時間，因此對同一樣品進行多次檢測的不確定度評定方法是不符合工作實際的。

5.2.9 關于合并不同樣本的標準差而評定樣品的不確定度 劉麗花等[9]、陳建琳等[10]、范媛媛等[11]提出，把一組不同時間，不同人員測量的樣品菌落總數結果用貝塞爾公式計算出檢測結果對數值標準差的合并樣本標準差，進而把該標準偏差當作其中任一樣品菌落數測量結果的標準不確定度;隨著檢驗結果的不斷增加，可隨時將新樣品的測定測量與以往樣品的測量結果混到一起重新計算合并樣本標準差，更新測量結果的標準不確定度取值范圍。從統計學上講，合并樣本標準差的計算必須是所有被合并計算的樣本測量結果都是在規定條件(測量重復性條件或測量復現性條件或期間測量精密度條件)下對同一或類似被測對象的重復測量的結果，同時樣品測量的目標含量應該穩定和接近。然而不同時間，不同人員在測量不同樣品時，樣品的菌落總數結果不同，檢測時的溫度，儀器的精密也可能不同，其菌落數檢測結果的不確定度也就不可能相同，另外如果把每次新樣品的測量結果與以往樣品的測量結果合并計算標準偏差時，就會產生一個新的合并樣品標準差作為新樣本測量結果的標準不確定度，這樣做法顯然是錯誤的，因為一個樣品檢測結果不確定度應該是確定的。

[1]JJF1059.1-2012，測量不確定度評定與表示[S].北京：北京質檢出版社，2010.

[2]GB/T4789.2-2010，食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].北京：北京標準出版社，2010.

[3]2015國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊（菌落總數標準操作程序）[S].北京：北京質檢出版社，2010.

[4]胡巔，丁李素芳.食品的菌落數檢測結果不確定度之評定[J].中國衛生檢驗雜志，2008，8（18）:1494-1497.

[5]JJG98-2006，非自動天平鑒定規程[S].

[6]JJG196-2006，常規玻璃器鑒定規程[S].

[7]周紅雨.泊松分布應用于菌落總數測得質量控制[J].中國衛生檢驗雜志，2000，6（10）:3317-3318.

[8]湯水平,王力清,李靜芳,等.嬰幼兒配方奶粉菌落總數檢驗中不確定度的評定[J].微生物學雜志，2009，5（29）:100-103.

[9]劉麗花，周紅，任永紅.菌落總數測定中的不確定度評定[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（34）:3317-3318.

[10]陳建琳，顧永洋，徐會.水中菌落總數測定不確定度評定的應用[J].中國衛生檢驗雜志，2016，20（26）:2931-2930.

[11]范媛媛，王樹祥，朱宇旌.食品菌落總數檢驗中不確定度的評定[J].中國衛生檢驗雜志，2007，2（17）:296-297.

[12]汪艷玲，趙懷榮，劉純成.農村生活飲用水菌落總數不確定度評定[J].中國衛生檢驗雜志，2016，21（26）:3123-3125.

R446.5

A

1672-5654（2017）06（c）-0041-04

2017-03-21）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.18.041

朱勇（1982-），男，重慶人，本科，主管技師，主要從事微生物檢驗工作。