香菇多糖對(duì)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型的作用

劉健雄，徐嘉輝，陳德明，潘嘉問(wèn)

(1.鶴山市人民醫(yī)院普通外科，廣東鶴山529700；2.廣東省中醫(yī)藥工程研究院，廣東廣州510095；3.鶴山市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東鶴山529700)

香菇多糖對(duì)腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型的作用

劉健雄1，徐嘉輝2，陳德明1，潘嘉問(wèn)3

(1.鶴山市人民醫(yī)院普通外科，廣東鶴山529700；2.廣東省中醫(yī)藥工程研究院，廣東廣州510095；3.鶴山市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東鶴山529700)

目的研究香菇多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型的作用。方法選取小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究載體，實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、香菇多糖高、中和低濃度組，共5組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。采用1 g/L、10 g/L、100 g/LTNF-α誘導(dǎo)建立炎癥細(xì)胞模型，予香菇多糖進(jìn)行給藥孵育，于37℃及5%CO2的條件下培養(yǎng)6 h，取上清樣品備測(cè)IL-6、IL-18與IL-23。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-6、IL-18與IL-23含量水平。結(jié)果采用10 g/L TNF-α誘導(dǎo)成功建立炎癥細(xì)胞模型。藥物孵育后，5組的IL-6、IL-18及IL-23水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低濃度組和模型組的IL-6[(38.85±4.49)pg/mL、(56.53±7.41)pg/mL、(82.16±5.48)pg/mL vs(97.50±12.04)pg/mL]、IL-18 [(28.26±4.54)pg/mL、(43.71±5.29)pg/mL、(52.62±6.55)pg/mL vs(80.27±6.90)pg/mL]及IL-23[(60.63±4.02)pg/mL、(74.91±7.64)pg/mL、(90.51±8.73)pg/mL vs(121.31±9.97)pg/mL]水平比較，香菇多糖高、中、低濃度組明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。香菇多糖高濃度組的IL-18水平與空白組相當(dāng)[(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76± 1.22)pg/mL]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，故而具有免疫調(diào)節(jié)作用，且高濃度香菇多糖能夠顯著減少IL-18的分泌。

腫瘤壞死因子-α；香菇多糖；胃癌；輔助化療

胃癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)研究表明，胃癌高發(fā)年齡為50～60歲[1]。隨著老年化問(wèn)題的日漸嚴(yán)重，我國(guó)已經(jīng)成為胃癌的高發(fā)國(guó)家之一，嚴(yán)重制約人們的生存質(zhì)量與臨床結(jié)局，給家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。手術(shù)治療是目前臨床診治胃癌行之有效的干預(yù)手段，但術(shù)后恢復(fù)與避免再發(fā)是臨床的重點(diǎn)與難點(diǎn)[2]。研究表明，術(shù)后輔助化療有利于提高患者的生存率，但化療藥物的毒副反應(yīng)相對(duì)亦會(huì)制約患者的生存質(zhì)量，因而尋找減少術(shù)后化療不良反應(yīng)及改善機(jī)體功能成為了目前的急切需求[3]。香菇多糖是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能用于術(shù)后化療的輔助治療[4]。本文通過(guò)研究香菇多糖對(duì)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的作用，探討其對(duì)改善機(jī)體抗炎免疫功能的作用機(jī)制，為胃癌術(shù)后化療恢復(fù)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，由美國(guó)Cellgro公司提供；澳洲胎牛血清，由美國(guó)Gibco公司提供；TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品，由羅氏公司提供；白介素(interleukin，IL)-6、IL-18和IL-23酶聯(lián)免疫試劑盒，由杭州聯(lián)科生物有限公司提供；香菇多糖注射液，由金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10920012。小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)；高速離心機(jī)由德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱由日本Sanyo公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞的傳代：以含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于37℃，5%CO2條件使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。采用一次性細(xì)胞刮刀進(jìn)行脫壁及傳代，每天換液1次，2 d傳代1次，傳至10代穩(wěn)定后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組接種以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)12 h。選擇貼壁及生長(zhǎng)良好的細(xì)胞板進(jìn)行試驗(yàn)，標(biāo)記并分為空白組、模型組、低濃度組、中濃度組及高濃度組，每孔設(shè)5個(gè)孔，邊緣采用PBS封板。

1.3.3 建立模型參考文獻(xiàn)方法，采用TNF-α誘導(dǎo)RAW267.4細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型：以37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；于模型組及香菇多糖高、中、低濃度組孔中加入濃度調(diào)至TNF-α 1 g/L、10 g/L、100 g/L的細(xì)胞培養(yǎng)基，在空白組孔中加入等量培養(yǎng)基，適應(yīng)性培養(yǎng)30 min，觀察貼壁情況。

1.3.4 給藥孵育建模后，以終濃度為100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L的香菇多糖注射液進(jìn)行加藥孵育，以等量37℃PBS加入空白組與模型組；輕輕震蕩數(shù)下，于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)6 h，取上清樣品備測(cè)IL-6、IL-18和IL-23。

1.3.5 檢測(cè)樣本采用酶聯(lián)免疫法對(duì)備測(cè)樣本進(jìn)行IL-6、IL-18和IL-23含量水平的檢測(cè)，按照說(shuō)明書方法檢測(cè)波長(zhǎng)選擇450 nm與570 nm，OD值使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算，其中，OD=OD450nm-OD570nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，組間兩兩比較采用Bonferroni分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的建立情況采用TNF-α濃度為1 g/L、10 g/L、100 g/L的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min進(jìn)行建模，10 g/L濃度水平的RAW264.7細(xì)胞出現(xiàn)變形，100 g/L濃度水平的RAW264.7細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重變形，甚至脫壁漂浮現(xiàn)象，而1 g/L濃度水平的RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有出現(xiàn)明顯變形壞死表現(xiàn)，見(jiàn)圖1。因此，采用10 g/L的濃度水平TNF-α誘導(dǎo)建立炎癥細(xì)胞模型進(jìn)行給藥孵育實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同濃度香菇多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23水平的影響藥物孵育后，各組的IL-6、IL-18及IL-23水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低濃度組IL-6、IL-18及IL-23水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但是，在IL-18含量方面，香菇多糖高濃度組與空白組相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(95%CI=-0.08～21.08，P＞0.05)，提示該藥高濃度組能夠顯著降低IL-18水平，見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度TNF-α作用下誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

表1 不同濃度香菇多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影響

表1 不同濃度香菇多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影響

注：與模型組比較，aP＜0.05；與空白組比較，bP＞0.05。

38.20±3.50 121.31±9.97 60.63±4.02a74.91±7.64a90.51±8.73a93.50 0.00空白組模型組高濃度組中濃度組低濃度組F值P值5 5 5 5 5 0.00 10.00 10.00 10.00 10.00 21.43±4.85 97.50±12.04 38.85±4.49a56.53±7.41a82.16±5.48a87.73 0.00 17.76±1.22 80.27±6.90 28.26±4.54ab43.71±5.29a52.62±6.55a103.29 0.00

3 討論

胃癌術(shù)后患者機(jī)體免疫功能低下，加之化療藥物的不良作用，加重了患者機(jī)體復(fù)合，從而影響機(jī)體恢復(fù)與生存質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能夠顯著改善胃癌根治術(shù)后化療患者外周T細(xì)胞亞群，通過(guò)激活CD4+細(xì)胞，從而提高機(jī)體抗炎免疫功能，但具體作用機(jī)制尚未明確闡明[5]。系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明，TNF-α的多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關(guān)，是我國(guó)胃癌危險(xiǎn)人群發(fā)病的重要因素之一[6]。同時(shí)，術(shù)后患者組織學(xué)的改變以及化療藥物自身對(duì)機(jī)體的作用均不同程度導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，常見(jiàn)低熱、疼痛等臨床癥狀，因而影響機(jī)體恢復(fù)。小鼠RAW264.7細(xì)胞是良好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)載體，被廣泛運(yùn)用于體外炎癥機(jī)制研究[7]。已有研究表明，TNF-α能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型[8]。本研究結(jié)果表明，以10 g/L濃度水平的TNF-α誘導(dǎo)建立炎癥細(xì)胞模型最為符合體外實(shí)驗(yàn)要求。

既往臨床研究表明，香菇多糖能夠提高中晚期胃癌FOLFOX4化療方案的療效，提高患者的耐受性與減少不良反應(yīng)的發(fā)生，其能明顯改善Th2細(xì)胞中IL-10的過(guò)度表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞克隆增殖以控制腫瘤的進(jìn)展[9]。本研究結(jié)果則表明，香菇多糖能夠顯著減少炎癥細(xì)胞模型IL-6、IL-18和IL-23的分泌，高濃度組IL-18水平與空白組正常水平相當(dāng)。IL-18是多功能促炎因子，不僅能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞和自殺細(xì)胞表達(dá)Fas配體介導(dǎo)細(xì)胞毒性，還能夠增強(qiáng)Th2細(xì)胞因子的分泌[10]，故香菇多糖在臨床實(shí)際中的抗炎免疫調(diào)節(jié)效果可能與調(diào)節(jié)IL-18的分泌相關(guān)。此外，Th17細(xì)胞在胃癌及術(shù)后也起到重要免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究認(rèn)為，IL-23可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移，因而IL-23在胃癌患者組織中出現(xiàn)高表達(dá)[11]。而本研究結(jié)果則表明，香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型的IL-23分泌。

綜上所述，香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，對(duì)Th2和Th17細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，且高濃度香菇多糖能夠顯著減少IL-18的分泌。

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Effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor-α.

LIU Jian-xiong1,XU Jia-hui2,CHEN De-ming1,PANG Jia-wen3.1.Department of General Surgery,Heshan People's Hospital,Heshan 529700,Guangdong,CHINA;2.Guangdong Engineering Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;3.Department of Oncology,Heshan People's Hospital,Heshan 529700, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.MethodsRAW 264.7 cell was used as the study model,and there were 5 groups including the blank group,model group,high,medium and low concentrations of lentinan group.The inflammatory cell models induced by TNF-α(1 g/L,10 g/L,100 g/L).Then under the situation of 37℃and 5%CO2,test groups were added lentinan to have the incubation with 6 h,and the supernatant was collected.The concentrations of interleukin (IL)-6,IL-18 and IL-23 were tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsIt is successful to use 10 g/L TNF-α to induce the inflammatory cell model.After the incubation,there were difference between five groups inthe concentrations of IL-6,IL-18 and IL-23(P＜0.05).Moreover,the concentrations of IL-6 of(38.85±4.49)pg/mL, (56.53±7.41)pg/mL,(82.16±5.48)pg/mL,respectively,IL-18 of(28.26±4.54)pg/mL,(43.71±5.29)pg/mL,(52.62± 6.55)pg/mL,respectively and IL-23 of(60.63±4.02)pg/mL,(74.91±7.64)pg/mL,(90.51±8.73)pg/mL,respectively in high,medium and low concentrations of lentinan group were obviously lower than(97.50±12.04)pg/mL,(80.27±6.90) pg/mL,(121.31±9.97)pg/mL in the model group(P＜0.05).However,there was no significant difference between the high concentration of lentinan group and blank one in the aspect of IL-18,(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76±1.22)pg/mL (P＞0.05).ConclusionLentinan can inhibit the secretion of IL-6,IL-18,and IL-23 in the cell model of inflammatory response induced by TNF-α,so it has immunomodulatory effect and the high concentration of lentinan could obviously decrease the section of IL-18.

Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Lentinan;Gastric cancer;Adjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.004

R735.2

A

1003—6350（2017）15—2423—03

2017-05-07)

廣東省江門市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研基金(編號(hào)：A2012738)

劉健雄。E-mail：13695812@qq.com