基因芯片早期檢測中樞神經系統感染耐藥基因

王海波，陳建，張春秀，管義祥，張強

·論著·

基因芯片早期檢測中樞神經系統感染耐藥基因

王海波，陳建，張春秀，管義祥，張強

目的 探討基因芯片技術在早期快速檢測中樞神經系統感染耐藥基因的臨床意義。方法 選取6種常見耐藥基因的特異性DNA序列,設計并制作PCR引物及相應的探針，對60例中樞神經系統感染患者的腦脊液行基因芯片檢測耐藥基因及病原菌，將結果與傳統腦脊液培養方法進行對比。結果 傳統腦脊液培養方法確診中樞神經系統感染24例；基因芯片方法確診中樞神經系統感染30例，并鑒定出菌種及耐藥基因，另有30例未鑒定出菌種，但仍多數檢出了耐藥基因。結論 基因芯片技術可以早期快速并靈敏的檢測出中樞神經系統感染細菌的耐藥基因，在早期明確診斷方面明顯優于腦脊液細菌培養法。

基因芯片；中樞神經系統感染；耐藥基因

中樞神經系統(CNS)感染是神經外科的常見病癥，常常來勢兇險，臨床治療難度大[1]，需要早期足量使用有效抗生素。大多數情況下明確診斷CNS感染需要依靠腦脊液(CSF)細菌培養，而CSF細菌培養用時較長，還極易受外部情況影響，并且有的很難培養，所以CSF細菌培養的陽性率不足10%[2]。同時由于耐藥基因 (drug resistance genes, DRGs )的存在，很多患者往往得不到及時有效的救治。現實中由于各種原因使得抗生素的大量使用，這導致菌株變異及出現耐藥性，單純依靠CSF細菌培養進行致病菌的鑒定明顯滯后于臨床治療。現今找到最新的技術來解決早期快速準確診斷CNS細菌感染顯得很迫切。基因芯片技術能在菌種不明的情況下快速準確診斷病原菌及DRGs，從而能解決如何選擇最佳藥物及怎樣合理用藥等難題[3]，并且它具有快速、高效、操作簡單、敏感度及準確性高等優點。本研究中我們設計及制作了小型基因芯片，同時選擇CNS感染常見致病菌的DNA特異序列，探討基因芯片早期檢測CNS感染DRGs的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例選擇及標本采集 根據南通大學附屬海安醫院神經外科常見CNS感染的高危因素并結合常見的臨床CSF細菌感染癥狀選擇實驗病例。選擇從2010年1月到2016年6月我院臨床上高度懷疑CNS感染病例60例，其中24例CSF培養陽性，包括10例金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus，SA)、6例肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KNP)、4例大腸桿菌(escherichiacoli，E.coli)以及4例肺炎雙球菌(pneumococci，PC)。臨床診斷CNS感染參考Harrison標準[4]，檢測的所有菌種是根據文獻報道臨床常見的致病菌確定，并結合神經外科開顱手術后CSF感染的特點[5]。主要有SA、KNP、E.coli及PC，同時選取它們的6個常見DRGs(meeA、OXA-23、SHV、CTX-M、TEM、PBPla)進行檢測。取5～8 ml CSF送細菌培養，取2 ml CSF送基因芯片檢測。所有CSF標本要求在1 h內送檢。

1.2 主要儀器及試劑儀器 分子雜交箱(ThermoHybaid，德國)，GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件(Axon Instruments/Molecular Devices Corp，美國)，OmniGridTM 100微陣列點樣(GeneMachine，美國)， PMC-082芯片離心機(TOMY，日本)，日立公司低溫離心機, GenPix 400B共聚焦激光掃描儀(Axon Instruments，美國)。試劑：Dneasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，美國)，光學級醛基化修飾芯片(博奧生物有限公司，北京)，Cy3-dUTP(pharmacia公司)，引物與探針(上海Invitrogen公司合成)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CSF標本的細菌培養與藥敏 細菌培養：選取接種環挑取渾濁CSF，后接種于巧克力瓊脂平板或血瓊脂平板上，在5% CO2培養箱中培養，設置35℃，24～48 h后涂片檢查，觀察菌群形態，鑒定何種細菌。藥敏步驟：接種環挑取上述的菌落，接種于肉湯培養皿中培養24 h，將增殖菌移至備有各種抗生素溶液的20孔板中，6 h后根據顏色培養藥敏結果。

1.3.2 基因芯片技術

1.3.2.1 CSF細菌DNA的提取 根據試劑盒操作說明書進行操作：選取CSF標本約2 ml在離心機中以8000xg離心10min，棄上清；加取等量滅菌生理鹽水充分震蕩，后懸浮沉淀，而后再次以8000xg離心10min，棄上清；加入180μL DNA裂解液，充分混勻震蕩，37℃下溫浴30min；加入25μL蛋白酶K，56℃下溫浴30min；加入200μL乙醇，樣本DNA通過離心柱提取。

1.3.2.2 引物設計及探針合成 在NCBI網站(http//www.ncbi.ulm.aih.gov/entrez)的Genbank數據庫中篩選出6種DRGs的特異DNA序列，進行分析后，篩選靶序列。由Primer Premier 5.0軟件設計菌株的PCR引物，選取細菌所共有的16S基因設計引物和探針來作為陽性對照物，所有引物和探針序列用Blast軟件對探針進行比較分析，排除同源性，由上海Invitrogen公司合成(表1)。

表1 多重PCR引物及芯片雜交探針序列

(續表1)

1.3.2.3 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA 將提取的DNA用PCR擴增，加入一定濃度的Cy3-dUTP熒光標記物至反應底物中，使其混入PCR擴增產物中，雜交后作為激光掃描儀掃描檢測的標記。實驗分兩組：第一組進行微生物檢測，第二組進行DRGs檢測；以實驗用水為陰性對照。擴增條件：95℃預變性30min，95℃變性5min，56℃退火31min，72℃延伸30min,35個循環。在冰上進行反應液配置，每個樣品重復3次。PCR產物分兩份，一份用于行瓊脂糖凝膠電泳；另一份避光保存于4℃冰箱，用于基因雜交。PCR產物予瓊脂糖凝膠電泳后判定結果：制備2%的瓊脂糖凝膠，待凝膠完全凝固，后將凝膠置入電泳槽中，電泳緩沖液超過膠面1cm,取10 uL PCR擴增產物和2 uL的6*上樣緩沖液混合，把混合物加入樣品槽中。蓋上電泳槽，選用電壓為150V，15min電泳時間。切斷電源，打開槽蓋，用BIO-RAD凝膠成像系統下自顯影觀察條帶，并記錄結果。

1.3.2.4 基因芯片的制備 首先對基片予活化處理，后用點樣液將合成的Oligo(探針)稀釋至濃度50mmol/L，并放入384孔板， 每孔10 uL。用點樣儀點樣探針于活化的基片上，點樣矩陣為10*7，各點隨機排列，每個探針位點重復3次(圖1)。點樣后將芯片洗凈、固定，并離心甩干，于干燥箱中保存備用。

1.3.2.5 基因芯片雜交與結果判定 將雜交液與備用的Cy3熒光標記聚合酶鏈式反應產物按2∶1比例離心機下混勻后的混合液在48℃下進行2h熱變性，待冰浴驟冷，加樣在芯片上的點樣區。封片后于42℃下水浴雜交2～3h，雜交結束后再清洗甩干，應用GenPix 400B共聚焦激光掃描儀(波長532nm)進行掃描。通過GenPix Pro 6.0圖像掃描和分析軟件提取每個探針位點的熒光信號強度值，除去低信號位點，探針信號大于cutoff值(SNR=3.0)的視為有效信號。

圖1 DRGs檢測芯片排布圖

注：P：positioning probe；N：negative control probe； B：blank control

2 結 果

多重PCR：根據在Genbank數據庫中篩選出的6種我院常見顱內CSF感染細菌的DRGs及四種常見細菌的特異DNA序列，設計出10對相應的引物，并將其應用于CSF標本致病菌DNA的擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見相應的清晰條帶(圖1)，顯示設計的引物序列有效、特異。

圖1 常見CNS感染細菌基因檢測的PCR產物電泳圖Lane 1,Staphylococcus aureus; 2, Klebsiella pneumoniae;3, Escherichia coli; 4, 16S; 5, Streptococcus pneumoniae;6,multiplex PCR of bacteria;7, Marker; 8, OXA-23; 9, mecA; 10, TEM; 11, CTX-M; 12, PBP1a; 13, SHV;14, multiplex PCR of resistance genes

24例CSF培養陽性的標本均鑒定出與培養一致的菌種。CSF培養結果和基因芯片比較24例細菌培養陽性的CSF標本通過基因芯片均鑒定出菌種，并檢出DRGs(圖2A)，其中SA10例，KNP6例，E.coli 4例，PC4例，與細菌培養結果一致。余下的細菌培養陰性的36例標本中仍有6例通過基因芯片鑒定出菌種及DRGs(圖2B)，其中SA2例，E.coli 4例。故基因芯片方法確診CNS感染30例，并鑒定出菌種及DRGs；未檢測出菌種的余下30例中有16例只檢出16S基因，未檢出菌種，但多數(12例)檢測出DRGs(圖2C)；14例未檢出16S基因及DRGs(圖2D)。

圖2 基因芯片檢測舉例A：Klebsiella pneumoniae+16S+CTX-M、TEM、SHV；B：Escherichia coli+16S+TEM；C：16S+mecA；D：negative

3 討 論

CNS感染的病原菌眾多[6-7]，在醫療工作中，不同的菌種有不同的檢測程序[8]。目前診斷CNS感染的“金標準”是細菌培養，同時還有很多臨床醫生依據臨床、CSF常規、生化及血常規等綜合指標來推測可能的病原菌感染[9]。而如今抗生素的廣泛使用可引起致病菌株變異及產生耐藥性，故抗生素治療效果常常不理想。怎樣選擇合理有效的抗菌藥物難度變大，故找到新的技術來解決如何快速、準確明確致病菌變的很緊迫。

基因芯片技術具有檢測范圍廣、檢測速度快、樣品用量少等特點，同時病原體的遺傳信息可以通過基因芯片技術準確、快速、高效地顯示。目前它已被廣泛使用于病原微生物的快速診斷、基因序列分析、基因分型、變異及耐藥機制研究、分子流行病學調查和抗感染藥物研制等方面[10-11]。基因芯片技術不僅可以快捷地檢測出耐藥性菌株，進行細菌診斷、鑒別診斷、耐藥性監測，而且可以檢測引起細菌耐藥的基因突變。如今基因芯片技術發展迅猛，目前檢測操作簡便同時效率高，在特短時間內已能用特少量的樣品檢測獲得多個基因的有效信息。標本中只要含有微量的DNA，甚至哪怕存在部分降解的DNA序列，通過PCR技術也可對樣本實施擴增，最終檢測出相應的致病菌[12]。抗菌治療藥物是影響CSF細菌培養檢出率的最重要因素，而通過PCR技術擴增靶細菌，可明顯減少這方面的影響。多種病原菌或DRGs可以通過多重PCR技術同時檢測，針對大量樣品序列可以一次進行檢測和分析。

本課題通過基因芯片技術原理[13]，進行了6個DRGs和4種細菌的檢測，1d內完成了對可疑CSF標本的檢測，這證明基因檢測手段是十分高效的[14], 對CNS感染的病原菌進行早期檢測非常適用。通過基因芯片技術確診30例CNS細菌感染病例，未檢測出菌種的余下30例中有16例只檢出16S基因，未檢出菌種，但多數(12例)檢測出DRGs，其原因在于我們所制備的PCR底物不包括這些致病菌的特異性DNA序列，但這些細菌仍保留著16S rRNA基因[15]。有36例CSF標本培養陰性，提示未能培養出致病菌，而基因芯片技術鑒定出菌種且檢測結果與CSF培養相一致，甚至于檢測出CSF培養陰性的CNS細菌感染。這充分證明：基因芯片技術在早期診斷CNS感染上有顯著優勢。并且有陽性菌種鑒定結果的標本均未出現兩種及以上的鑒定結果，這說明基因芯片技術特異性很高。

致病菌產生耐藥性是微生物界的常見現象。在CSF培養陰性的情況下，DRGs檢測結果是唯一可供參考的指標。菌種不明的情況下可以通過基因芯片技術早期快速檢測出常見的DRGs，而后根據不同DRGs的作用機制，為早期正確合理使用有效抗生素指明方向[16]。通過對病原體耐藥性的分子遺傳學基礎研究及同時對細菌耐藥性檢測及耐藥機制研究表明：可通過不同機制細菌可以產生耐藥性的基因改變。故找到耐藥菌的DRGs，從而為臨床治療實現針對性用藥提供理論依據，這變得非常重要及有意義。本研究中基因芯片的檢測結果與藥敏試驗結果相印證，這證明了DRGs檢測的可靠性。根據對DRGs的檢測，還可避免選擇耐藥抗生素。基因芯片檢測具有簡便、快速、準確、穩定等優點，對于臨床樣本檢測及流行病學的現場調查非常適用[17-18]。當然基因芯片技術目前也有許多缺點需要解決，但隨著基因芯片技術的發展，對于CSF細菌培養陽性率低的疾病而言，基因芯片技術早期檢測DRGs將有很好的應用前景。

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(收稿2016-11-16 修回2016-12-21)

Early detection of resistance genes in the central nervous system infection by gene chip technology

WANGHai-bo,CHENJian,ZHANGChun-xiu，etal.
DepartmentofNeurosurgery,HaianHospitalAffiliatedtoNantongUniversity,Nantong226600,China

CHENJian

Objective To investigate the clinical significance of the gene chip technology for early detection of resistance genes in the central nervous system(CNS) infection .Methods Six kinds of common resistance gene-specific DNA sequences were selected to design and produce the corresponding PCR primers and probes to detect resistant genes and pathogens in 60 cases of cerebrospinal fluid(CSF) of patients with CNS infections,and cerebrospinal fluid culture results with the conventional method were for comparison.Results CSF confirmed the traditional culture methods were 24 cases of CNS infection,gene chip intracranial infections were diagnosed in 30 cases,intracranial infection pathogens and resistance genes identified,and another 30 cases of unidentified species,but most resistance genes still detected.Conclusion Gene chip technology can quickly and sensitive detect bacterial resistance genes in patients with CNS infections in early stage,and the technology is superior to cerebrospinal fluid bacterial culture for rapid clearly diagnosis.

gene chip;central nervous system infection;resistance gene

南通市社會發展科技計劃資助項目(S10935)

22660南通 ，南通大學附屬海安醫院神經外科(王海波，管義祥，張強)；南通大學附屬醫院神經外科(陳建)；生物芯片上海國家工程研究中心研發部(張春秀)

陳建

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.04.013

R446.5

A

1672-7770(2017)04-0291-05