Pdx1和Cre-LoxP重組酶系統對iPSCs及其分化為胰島素分泌細胞的調控機制

李夢夢

（第二軍醫大學附屬長征醫院風濕免疫科，上海 200003）

Pdx1和Cre-LoxP重組酶系統對iPSCs及其分化為胰島素分泌細胞的調控機制

李夢夢

（第二軍醫大學附屬長征醫院風濕免疫科，上海 200003）

目的通過檢測Pdx1表達或者缺失的胰島細胞分化發育的情況，探討Pdx1基因對胰島素分泌細胞分化的調控機制。方法通過Cre-LoxP重組酶系統，在胰腺組織特異性敲除Foxa2基因，對該基因型小鼠的血糖、胰島素含量、胰高血糖素含量進行測定，對檢測結果進行統計學分析。檢測該基因型小鼠胚胎發育和干細胞誘導分化后，胰島β細胞和胰島α細胞的含量。結果胰腺特異性敲除Foxa2基因的小鼠表現出血糖低、胰島素高、胰高血糖素低、胰島β細胞多。對胚胎和干細胞的發育監測結果顯示，敲除Foxa2基因，胰島細胞傾向于發育成胰島β細胞，而胰島α細胞數量減少。將Foxa2敲除的干細胞移植到糖尿病小鼠胰腺中，可以有效降低糖尿病小鼠的血糖。結論Pdx1抑制基因Foxa2敲除后，對胰島素分泌細胞的分化發育具有促進作用。這對胰島干細胞和胰島移植的研究具有重要的指導作用。

胰島細胞；胰島素；Cre-LoxP重組酶系統；細胞分化

糖尿病的主要致病原因為其胰島β細胞的損害，導致胰島素分泌不足，或者因為胰島素抵抗致使胰島細胞超負荷運轉造成功能的損傷[1]。胰島移植被認為是目前最有希望治愈糖尿病的方法之一[2]。Cre-Loxp系統通過Cre重組酶對LoxP序列的識別，可以高效的實現對基因的重組改造作用，使其能在適當的位置上對基因進行操作。

1 材料與方法:

1.1 實驗動物:

Mesp1-Cre（C57BL/6）小鼠，Foxa2loxp/loxp（C57BL/6）小鼠，ROSA26-EYFP（C57BL/6）小鼠均購自美國The Jackson Laboratory，雌雄各一只。

1.2 方法

1.2.1 胰腺特異敲除Foxa2小鼠（MCFFA）模型的建立和研究對象的分組

將Mesp1-Cre小鼠與Foxa2loxp/loxp小鼠進行雜交，對后代進行基因型檢測。選取后代基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+的雌鼠以及基因型為Mesp1+/+Foxa2loxp/loxp的雄鼠進行雜交，對后代基因型進行檢測。其中基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/loxp的小鼠為胰腺特異敲除Foxa2的小鼠。

用基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+的雄性小鼠和基因型為Foxa2loxp/loxpROSA26-EYFP-/-的雌性小鼠進行雜交，后代中基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/loxpROSA26-EYFP-/-的為純合子組（homo組），基因型為Mesp1Cre/+Foxa2loxp/+ROSAEYFP-/-的作為雜合子組（het組）。以基因型為Mesp1Cre/+的雄性小鼠和基因型為ROSA26-EYFP-/-的雌性小鼠的雜交后代作為對照組。

1.2.2 MMR干細胞的培養及擬胚體形成

按照lineage tracing中的方法進行小鼠雜交，取13.5天的胚胎，按照1:4進行傳代培養。Plate-E細胞復蘇后隔天換液，細胞融合度達到70%-80%后，更換無血清的新鮮培養基，次日轉染。用LipofectaminTM 2000脂質體轉染試劑對Plate-E細胞進行轉染和病毒包裝，培養3周后，挑去克隆接種到飼養層細胞上培養，繼而擬胚體形成并向胰腺前體分化。

1.2.3 糖尿病小鼠模型構建的干預

將小鼠適應性喂養5天，然后禁食12 h，并且連續3天腹腔注射2%的STZ溶液（150 mg/kg），同時采用高糖、高脂飼料進行喂養。監測血糖，當出現高血糖的表形式，糖尿病小鼠模型構建完成。

1.2.4 小鼠胰島素和胰高血糖素水平的測定

對小鼠進行尾靜脈采血，將得到的血置于1.5 ml離心管中，室溫放置2小時后，4℃冰箱內放置3小時或者過夜。待血液凝固成血塊后，4000 rpm離心10分鐘，取上清于干凈的離心管中，血清樣品可于-20 ℃保存。按照小鼠胰島素ELISA試劑盒和胰高血糖素ELISA試劑盒說明中步驟，對小鼠血清樣品中胰島素和胰高血糖素水平進行檢測。

2 結 果

2.1 MCFFA小鼠血糖、胰島素和胰高血糖素的測定

測定野生型、雜合子和純合子小鼠各5只，先饑餓2小時，然后測定血清中胰島素和胰高血糖素的含量，與其他兩種基因型比較，發現純合子小鼠血清中胰島素的含量明顯偏高，而血清中以高血糖素的含量明顯偏低，該結果提示Mesp1子代小鼠中敲除foxa2可引起高胰島素血癥性低血糖。見表1，表2。

表1 MCFFA小鼠喂食和禁食16 h情況下小鼠血糖

表2 MCFFA小鼠血清中胰島素和胰高血糖素含量

2.2 胰島細胞分化變化

在對照組小鼠中和實驗組中的雜合子小鼠的胰腺組織中，GFP與胰島α細胞和胰島β細胞均有共染，而在實驗組中的純合子后代的胰腺組織中，GFP只與胰島β細胞有共染，該結果說明在Mesp1子代小鼠中將Foxa2敲除后，會導致胰島細胞分化發育方向的改變，更多的向胰島β細胞發育。見表3。

表3 胰島β細胞和胰島α細胞與GFP細胞共染情況

2.3 MMR細胞對糖尿病小鼠的改善作用

用低劑量的STZ誘導誘導小鼠建立糖尿病小鼠模型，在誘導的第4天，監測血糖，發現小鼠的血糖高達到17 mmol/L遠高于正常小鼠的血糖。見表4。

表4 胰島素小鼠模型注射MMR細胞后血糖變化

3 討 論

2 型糖尿病發病機制主要是胰島素抵抗和胰島素分泌不足[3]。胰島素抵抗使胰島細胞代償性的增加胰島素分泌，導致胰島細胞超負荷運轉，最終造成胰島衰竭，功能喪失和胰島細胞凋亡[4]。胰島干細胞治療可有效解決供體細胞來源問題。Pdx1又稱胰島素啟動子1，是決定胰腺分化發育和胰島功能的主要調節基因。在胚胎發育過程中，內胚層Pdx1的表達將分化為胰腺，將該基因敲除后，小鼠由于缺乏胰腺而在胚胎期死亡；出生后特異敲除β細胞Pdx1的小鼠可發生糖尿病[5]，在人類Pdx1基因的突變也可導致糖尿病的發生。Pdx1對胰島素的治療的研究中表明，將Pdx1基因導入細胞內，可以誘導非胰島β細胞中內源性胰島素的表達[6]。在體外對非胰島β細胞進行Pdx1的記憶的修飾，可使其轉化為胰島素分泌細胞[7]。因此，Pdx1對胰島細胞的分化具有重要的調控作用，但其具體調控機制尚不明確。本研究中，采用Cre-LoxP重組酶系統，在小鼠體內胰腺組織特異性的敲除Pdx1的抑制基因Foxa2，使Pdx1表達量增加。對胰腺特異性敲除Foxa2的小鼠的研究中，發現當敲除Foxa2后，小鼠表現為胰島素高，胰高血糖素低，導致血糖偏低。對組織細胞的進一步分析表明，敲除Foxa2后小鼠表現為胰島β細胞的異常增多。對胰島細胞分化的研究進一步表明，在Foxa2敲除的小鼠體內，胰島細胞發育過程中傾向于向胰島β細胞的發育。將Foxa2敲除的干細胞移植到糖尿病小鼠體內，可以促進糖尿病小鼠體內胰島β細胞的增生，有效降低糖尿病小鼠的血糖。

綜上所述，Pdx1在胰島細胞發育過程中主要機制是，促進胰島細胞向具有胰島素分泌功能的胰島β細胞發育。

[1] Kaneto H, Katakami N, Kawamori D, et al.Involvement of oxidative stress in the pathogenesis of diabetes [J].Antioxid Redox Signal.2007, 9(3): 355-366.

[2] Liu X, Zheng P, Wang X, et al.A preliminary evaluation of efficacy and safety of Wharton’s jelly mesenchymal stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus [J].Stem Cell Res Ther, 2014, 5(2): 57.

[3] Wajchenberg BL.Beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment [J].Endocr Rev.2007, 28(2): 187-218.

[4] Prentki M, Nolan CJ.Islet beta cell failure in type 2 diabetes [J].JClin Invest.2006, 116(7): 1802-1812.

[5] Chen S, Borowiak M, Fox JL, et al.A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage [J].Nat Chem Biol, 2009, 5: 258-265.

[6] Serafimidis I, Rakatzi I, Episkopou V, et al.Novel effectors of directed and Ngn3-mediated differentiation of mouse embryonic stem cells into endocrine pancreas progenitors [J].Stem Cells, 2008, 26: 3-16.

[7] Babu DA, Chakrabarti SK, Garmey JC, et al.Pdx1 and BETA2/ NeuroD1 participate in a transcriptional complex that mediates Short-range DNA looping at the Insulin gene [J].J Biol Chem, 2008, 283: 8164-8172.

本文編輯：李新剛

Regulatory mechanism of Pdx1 and Cre-LoxP recombinase system on mouse iPSCs and its differentiation into insulin secreting cells

LI Meng-meng
(Department of Rheumatology and Immunology, Changzheng Hospital Affiliated to Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

ObjectiveTo observe the differentiation of Pdx1 expressing or Pdx1 deficient cells, we discussed the regulatory mechanism of Pdx1 gene on the differentiation of insulin secreting cells.MethodsWe bulid pancreatic tissue specific Foxa2 gene knockout mice by Cre-LoxP recombinase system, and measure the mice’s blood glucose, insulin and glucagon levels.Detected the number of pancreatic islet beta cells and islet alpha cells during mice embryonic development and induced differentiation of stem cells.ResultsThe pancreatic specific knock out Foxa2 gene showed low blood glucose, high insulin, low glucagon and increased number of islet beta cells.The development of embryonic and stem cells showed that, in addition to knocking down the Foxa2 gene, the islet cells tended to develop into pancreatic beta cells, while the number of islet alpha cells decreased.Transplantation of Foxa2 knockdown stem cells into the pancreas of diabetic mice can effectively reduce its blood glucose.Conclusionknockdown of Pdx1 suppressor gene Foxa2 can promote the differentiation and development of insulin secreting cells.It has an important guiding role in the study of islet stem cells and islet transplantation.

Islet cells; insulin; Cre-LoxP recombinase system; Cell differentiation

R-332

A

ISSN.2095-8242.2017.026.4953.03