胃腸轉流術對鏈脲佐菌素所致大鼠胰腺損傷的影響

張琪，鄭陽，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國志，王長友

(華北理工大學附屬醫院，唐山063000)

胃腸轉流術對鏈脲佐菌素所致大鼠胰腺損傷的影響

張琪，鄭陽，楊光華，單雨靜，趙永魁，張博，陳建立，張國志，王長友

(華北理工大學附屬醫院，唐山063000)

目的 探討胃腸轉流術對鏈脲佐菌素(STZ)所致胰島損傷大鼠的影響并探討其機制。方法 選擇SD大鼠30只，隨機分為空白對照組、模型組、代謝手術組各10只。代謝手術組行改良Roux-en-Y胃腸轉流術，空白對照組、模型組僅做單純開腹、關腹處理。手術7 d后，模型組、代謝手術組均腹腔注射STZ建立糖尿病模型，空白對照組腹腔注入等量生理鹽水。分別于造模前1天、造模后第7、14天時抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測血糖水平。于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿C肽水平，以評價胰島損傷情況。于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時抽取空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿TNF-α水平。于造模第2天時取胰腺組織，采用Western blotting法檢測凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤-2相關蛋白X(Bax)、B細胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)表達。結果 造模后第7、14天時，模型組血糖高于造模前及同時間點空白對照組，代謝手術組血糖低于模型組(P均<0.01)。造模后第7、14天時，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時點空白對照組，代謝手術組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。造模后24 h及第7天時，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時間點空白對照組，代謝手術組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。與代謝手術組相比，模型組Bcl2蛋白表達降低，CHOP、Bax蛋白表達增高(P均<0.01)。結論 胃腸轉流術可減輕STZ導致的大鼠胰腺組織損傷，其機制可能與減輕胰島細胞的炎癥反應、抑制胰島細胞凋亡有關。

糖尿病；代謝手術；胃腸轉流術；鏈脲佐菌素；胰島；凋亡；炎癥

根據流行病學調查統計，中國糖尿病總人數已達9 000萬，已經成為糖尿病患病率最高的國家[1]。目前，我國對于糖尿病的治療方法仍然是依靠降糖藥物及胰島素注射等傳統藥物方式。糖尿病的外科手術由減肥手術演變而來[2]，隨后Pories等[3]第一次報道了代謝手術治療糖尿病的效果。目前，代謝手術的應用主要包含限制性手術和胃腸轉流術兩種手術方式。前瞻性研究指出，在所有手術方式中，胃腸轉流術的治療效果最佳，因此，胃腸轉流術已被作為代謝手術的金標準[4]。多個臨床研究表明，采用代謝手術可使糖尿病患者達到臨床緩解甚至臨床完全“治愈”，但具體機制尚不清楚。本課題組在進行胰島移植實驗中偶然發現，若先行胃腸轉流術再經腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型時，大鼠胰島的破壞及糖尿病的發生并沒有預想中的出現，即使出現也很輕微[5]。因此我們推測，胃腸轉流術可能對糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護作用，但其是否可用于糖尿病的預防和治療尚不明確。2016年3～12月，我們對SD大鼠采用改良Roux-en-Y胃腸轉流術后再經腹腔注射STZ，觀察胃腸轉流術對STZ所致大鼠胰島損傷的影響，探討代謝手術預防和治療糖尿病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 SPF級雄性SD大鼠30只，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma-Aldrich公司；大鼠C肽酶聯免疫吸附測定試劑盒及炎性因子TNF-α酶聯免疫吸附測定試劑盒購于美國Rapidbio公司；B細胞淋巴瘤蛋白-2(Bcl2)、C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)、B細胞淋巴瘤-2相關蛋白X(Bax)單抗購于美國Sigma公司；羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP 及Western 印跡相關試劑購于北京Solarbio科技有限公司。

1.2 分組及干預方法 應用隨機數字表法將30只大鼠分為3組即空白對照組、模型組、代謝手術組，每組各10只。代謝手術組行改良Roux-en-Y胃腸轉流術[6]。大鼠術前稱重，按0.2 g/kg水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手術臺,取上腹部正中切口進入腹腔，結扎幽門后，于Treitz韌帶以遠10 cm處切斷空腸并結扎封閉兩斷端，將遠端空腸與胃做側側吻合，近端空腸于胃-空腸吻合口以遠15 cm處與遠端空腸做側側吻合。術后當天禁食水，術后第1天喂食糖鹽水，術后第2天給予腸外營養液，術后第3天恢復正常飼養。空白對照組、模型組僅做單純開腹、關腹處理。

1.3 模型制備 手術7 d后，模型組、代謝手術組均按60 mg/kg腹腔注射STZ建立糖尿病模型。空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 血糖檢測 分別于造模前1天、造模后第7、14天時，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，檢測血糖水平。

1.5 血漿C肽水平檢測 分別于造模前1天、造模后2 h、造模后第7、14天時，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿C肽水平，以評價胰島損傷情況。

1.6 血漿TNF-α水平檢測 分別于造模前1天、造模后24 h、造模后第7天時，抽取各組大鼠空腹尾靜脈血，采用ELISA法檢測血漿TNF-α水平。

1.7 胰腺組織凋亡相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測胰腺組織凋亡相關蛋白Bcl2、CHOP、Bax表達。于造模第2天，各組隨機選取2只大鼠處死，取胰腺組織，組織剪剪碎胰腺組織后上勻漿機充分研磨，RIPA裂解液充分裂解組織，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100 ℃變性5 min，-80 ℃保存備用。進行SDS-PAGE蛋白電泳，行轉膜、10%脫脂奶封閉，分別加入Bcl2、CHOP、Bax一抗(1∶1 000)孵育過夜，二抗(1∶100)37 ℃孵育2 h，熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。蛋白表達量=(所測蛋白灰度值/內參灰度值)×100%。

2 結果

2.1 各組血糖比較 造模后第7、14天時，模型組血糖高于造模前及同時間點空白對照組，代謝手術組血糖低于模型組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組不同時點血糖比較

注：與空白對照組同時點比較，*P<0.01；與代謝手術組同時點比較，﹟P<0.01。

2.2 各組血漿C肽水平比較 造模后第7、14天時，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時點空白對照組，代謝手術組血漿C肽水平均低于模型組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組不同時點血漿C肽水平比較

注：與空白對照組同時點比較，*P<0.01；與代謝手術組同時點比較，﹟P<0.01。

2.3 各組血漿TNF-α水平比較 造模后24 h及第7天時，模型組血漿TNF-α水平均高于造模前及同時間點空白對照組，代謝手術組血漿TNF-α水平均低于模型組(P均<0.01)。

表3 各組不同時點血漿TNF-α水平比較

注：與空白對照組同時點比較，*P<0.01；與代謝手術組同時點比較，﹟P<0.01。

2.4 各組胰腺組織凋亡相關蛋白表達比較 與代謝手術組相比，模型組Bcl2蛋白表達降低，CHOP、Bax蛋白表達增高(P均<0.01)。代謝手術組與空白對照組各蛋白表達差異無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組胰腺組織Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與代謝手術組比較，﹟P<0.01。

3 討論

與過去20年相比，我國糖尿病發病率已經增加了近4倍，其中，2型糖尿病占93.7%[7]。外科干預治療2型糖尿病是一種新型方案。目前研究顯示，與傳統內科治療方法相比，代謝手術在緩解2型糖尿病、減少并發癥發生、控制體質量方面具有更明顯的優勢[8, 9]。薈萃分析研究顯示[10]，在降低患者血糖水平、減少用藥量、降低并發癥發生率等方面，對

圖1 各組Bcl2、CHOP、Bax蛋白表達比較(Western blotting法)

2型糖尿病患者最有效的手術方式為胃腸轉流術。目前，胃腸轉流術已成為代謝手術中最有效且常用的手術方式。代謝手術方式中的胃腸轉流術在治療糖尿病上的效果已經越來越得到學術界專家的認可，在臨床上也得到了多次的驗證，但是對于胃腸轉流術治療糖尿病的機制目前仍不明確。本課題組前期中發現，先行胃腸轉流術再經腹腔注射STZ時，大鼠胰島的破壞并不明顯，糖尿病也并未出現，因此推測胃腸轉流術可能對糖尿病大鼠胰島的破壞和功能損傷具有一定的保護作用。

目前研究認為，代謝手術治療糖尿病的主要機制是通過改變胃腸道的解剖結構，使近端消化道分泌的抑制胰島β細胞功能、產生胰島素抵抗的胰島抑制性激素減少，遠端消化道分泌的腸促胰島激素增加，進而刺激胰島β細胞對胰島素的分泌和釋放[11, 12]、增強胰島素的敏感性[13]、促進胰島β細胞的增殖[14]。空腹血漿C肽水平與胰島功能呈正比關系。本研究發現，造模后第7、14天時，模型組血糖水平均高于造模前及同時點空白對照組和代謝手術組，模型組血漿C肽水平均低于造模前及同時點空白對照組和代謝手術組，提示代謝手術對于STZ所致的胰島損傷具有保護作用，可以提高大鼠胰島功能，保護胰島細胞，進而發揮降低血糖作用[15]。

炎癥因子和胰島β細胞凋亡在胰島素抵抗及2型糖尿病發病機理中的作用也逐漸受到學者們的關注[16～18]。胰島素抵抗和2型糖尿病均呈現出一種慢性低度的炎癥反應狀態，表現為TNF-α等炎性因子水平升高，而TNF-α可通過使胰島β細胞產生過多的自由基并誘導內質網應激，從而使之凋亡[19, 20]。研究證實，代謝手術后患者炎癥因子水平明顯降低，并且對胰島素抵抗和2型糖尿病相關并發癥的遠期改善率有益[21]。本研究發現，造模后24 h及第7天時，模型組血漿TNF-α水平高于空白對照組，且代謝手術組血漿TNF-α水平低于模型組，提示糖尿病大鼠血漿TNF-α水平增高，出現炎癥反應，而代謝手術可以減輕STZ所致的胰島細胞炎癥反應。

CHOP是內質網應激啟動凋亡的重要信號分子，當出現內質網應激時CHOP可被大量激活，進而改變Bcl家族成員的表達，從而啟動細胞凋亡[22]。本研究結果顯示，模型組大鼠胰腺組織CHOP蛋白的表達較空白對照組和代謝手術組增高，提示糖尿病大鼠的胰腺組織存在CHOP介導的內質網應激、凋亡活性增強，而代謝手術可有效干預CHOP蛋白的表達，從而改善內質網應激、減少細胞凋亡，這可能是代謝手術保護胰島損傷的作用機制之一。另外，代謝手術組大鼠胰腺組織Bcl2蛋白表達較模型組顯著升高、Bax蛋白表達明顯降低，提示代謝手術可能是通過下調Bcl2/Bax表達水平、抑制糖尿病大鼠胰島細胞凋亡，進而發揮對胰腺組織的保護作用。

綜上所述，胃腸轉流術可減輕STZ導致的大鼠胰腺組織損傷，其機制可能與減輕胰島細胞的炎癥反應、抑制胰島細胞凋亡有關。

[1] Drossman DA. The functional gastrointestinal disorders and the Rome III process[J]. Gastroenterology, 2006,130(5):1377-1390.

[2] Mason EE, Ito C. Gastric bypass in obesity[J]. Surg Clin North Am, 1967,47(6):1345-1351.

[3] Pories WJ, Swanson MS, MacDonald KG, et al. Who would have thought it? An operation proves to be the most effective therapy for adult-onset diabetes mellitus[J]. Ann Surg, 1995,222(3):339-350.

[4] Wong SK, Kong AP, Mui WL, et al. Laparoscopic bariatric surgery: a five-year review[J]. Hong Kong Med J, 2009,15(2):100-109.

[5] 鄭陽. 胃轉流術聯合胰島移植治療糖尿病大鼠的實驗研究[D]. 天津:天津醫科大學, 2013.

[6] 胥平湘, 鄭陽, 楊光華, 等. 改良式十二指腸空腸轉流術動物模型的建立與評價[J]. 中國現代普通外科進展, 2015,18(10):830-832.

[7] Yang W, Lu J, Weng J, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2010,362(12):1090-1101.

[8] Schauer PR, Bhatt DL, Kashyap SR. Bariatric surgery versus intensive medical therapy for diabetes[J]. N Engl J Med, 2014,371(7):682.

[9] Mingrone G, Panunzi S, De Gaetano A, et al. Bariatric surgery versus conventional medical therapy for type 2 diabetes[J]. N Engl J Med, 2012,366(17):1577-1585.

[10] Muller-Stich BP, Senft JD, Warschkow R, et al. Surgical versus medical treatment of type 2 diabetes mellitus in nonseverely obese patients: a systematic review and meta-analysis[J]. Ann Surg, 2015,261(3):421-429.

[11] Carswell KA, Belgaumkar AP, Amiel SA, et al. A systematic review and meta-analysis of the effect of gastric bypass surgery on plasma lipid levels[J]. Obes Surg, 2016,26(4):843-855.

[12] Kim SJ, Choi WS, Han JS, et al. A novel mechanism for the suppression of a voltage-gated potassium channel by glucose-dependent insulinotropic polypeptide: protein kinase A-dependent endocytosis[J]. J Biol Chem, 2005,280(31):28692-28700.

[13] Kwan EP, Gaisano HY. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells[J]. Diabetes, 2005,54(9):2734-2743.

[14] Kindel TL, Yoder SM, Seeley RJ, et al. Duodenal-jejunal exclusion improves glucose tolerance in the diabetic, Goto-Kakizaki rat by a GLP-1 receptor-mediated mechanism[J]. J Gastrointest Surg, 2009,13(10):1762-1772.

[15] Sims EK, Chaudhry Z, Watkins R, et al. Elevations in the fasting serum proinsulin-to-C-peptide ratio precede the onset of type 1 diabetes[J]. Diabetes Care, 2016,39(9):1519-1526.

[16] DePaula AL, Macedo AL, Mota BR, et al. Laparoscopic ileal interposition associated to a diverted sleeve gastrectomy is an effective operation for the treatment of type 2 diabetes mellitus patients with BMI 21-29[J]. Surg Endosc, 2009,23(6):1313-1320.

[17] Duncan BB, Schmidt MI, Pankow JS, et al. Low-grade systemic inflammation and the development of type 2 diabetes: the atherosclerosis risk in communities study[J]. Diabetes, 2003,52(7):1799-1805.

[18] Freeman DJ, Norrie J, Caslake MJ, et al. C-reactive protein is an independent predictor of risk for the development of diabetes in the West of Scotland Coronary Prevention Study[J]. Diabetes, 2002,51(5):1596-1600.

[19] Lu Z, Shen SX, Zhi DJ, et al. Protective effect of cotransfection of A20 and HO-1 gene against the apoptosis induced by TNF-alpha in rat islets in vitro[J]. Zhonghua Er Ke Za Zhi, 2013,51(6):420-425.

[20] Bhattacharjee A, Prasad SK, Pal S, et al. Possible involvement of iNOS and TNF-alpha in nutritional intervention against nicotine-induced pancreatic islet cell damage[J]. Biomed Pharmacother, 2016,84:1727-1738.

[21] Whitlock G, Lewington S, Sherliker P, et al. Body-mass index and cause-specific mortality in 900 000 adults: collaborative analyses of 57 prospective studies[J]. Lancet, 2009,373(9669):1083-1096.

[22] Lu HY, Chen XQ, Tang W, et al. GRP78 silencing enhances hyperoxia-induced alveolar epithelial cell apoptosis via CHOP pathway[J]. Mol Med Rep, 2017,16(2):1493-1501.

河北省醫學科學研究重點課題計劃項目(20150085)；河北聯合大學科學研究基金項目任務(Z201427)

王長友(E-mail: fhbj-2004@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.30.009

R587.1

A

1002-266X(2017)30-0033-04

2017-04-03)