檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯系統中鈉離子影響機制的探究及其去除

鮑家偉，徐健，蘇先峰，張宏建，毛忠貴

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯系統中鈉離子影響機制的探究及其去除

鮑家偉，徐健，蘇先峰，張宏建，毛忠貴

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

為解決檸檬酸發酵過程中產生的廢水問題，提出了檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯系統。在該系統中，檸檬酸發酵廢水經中溫厭氧消化和水資源化處理后作為配料水回用于下一批次檸檬酸發酵，從而實現廢水零排放。厭氧消化出水中的主要抑制物質是Na+，在回用過程中其質量濃度最高達到1 000 mg/L，會嚴重抑制檸檬酸發酵。采用電滲析法對厭氧消化出水中的高濃度Na+進行去除，循環回用10批后，平均檸檬酸產量為142.4±2.1 g/L，達到去離子水發酵水平(141.5 g/L)。1 000 mg/L Na+會造成檸檬酸發酵前期培養基pH快速下降，黑曲霉細胞分泌的糖化酶和異麥芽糖酶活力降低，部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，檸檬酸產量顯著下降。在檸檬酸發酵開始時添加18 g/L CaCO3可以延緩發酵初期培養基pH的下降速率，促進部分糊精和異麥芽糖的水解，從而使可利用糖濃度增加，減輕高濃度 Na+對檸檬酸發酵的抑制作用。但是，CaCO3會造成發酵前期培養基pH較高，副產物草酸大量積累，檸檬酸產量為139.2 g/L，仍低于去離子水發酵水平。

檸檬酸；厭氧消化；碳酸鈣；Na+；異麥芽糖酶；糖化酶

檸檬酸(2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸)是一種重要的有機酸，主要用于食品、醫藥和化學工業，并且在石油、建筑、陶瓷、鑄造和紡織等工業領域中也有很廣泛的應用[1-2]。目前，檸檬酸主要是以木薯和玉米淀粉為原料，黑曲霉為生產菌株進行液態深層發酵生產的[3-4]。在該生產模式下，會產生大量的發酵性廢水。這些廢水具有高化學需氧量(15 000～20 000 mg/L)和低pH值(4.5～4.8)等特點，不經過處理直接排放會對環境造成嚴重的危害[5-6]?，F今，檸檬酸廢水主要通過“厭氧-好氧”這一工藝進行處理，達到二級排放標準后排入附近水體[7]。厭氧消化單元在高濃度有機廢水處理方面具有高效率、低能耗等優點，產生的沼氣和厭氧污泥具有一定的經濟效益[8]；但好氧消化單元存在著設備占地廣，投資及運行費用高等問題，是一個高能耗、純投入的過程。隨著國家工業廢水排放標準的日益嚴格，如何高效處理檸檬酸廢水成為制約當前檸檬酸行業健康發展的瓶頸[9]。

為解決上述問題，本實驗室提出了“檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯系統”，如圖1所示。黑曲霉以木薯和玉米淀粉為原料生產檸檬酸，經提取后發酵液中不能被黑曲霉利用的纖維素、果膠等物質以及黑曲霉本身的代謝副產物則通過中溫厭氧消化轉化成沼氣；所得沼氣經脫硫處理后通過熱電聯產技術轉變為電和熱；厭氧消化出水經過水資源化處理后，作為配料水回用到下一批次檸檬酸發酵過程中，從而解決檸檬酸廢水排放問題并節約水資源[10]。

圖1 檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯工藝流程圖Fig.1 Flow chart of the integrated citric acid-methane fermentation process

厭氧消化出水中的主要抑制物質是Na+，在回用過程中其濃度最高可達到1 000 mg/L，會嚴重抑制檸檬酸發酵[11]。當培養基中添加的Na+濃度超過200 mg/L時，黑曲霉細胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶的活力開始受到抑制，殘總糖濃度升高，檸檬酸產量顯著下降[12]。本文采用電滲析法去除厭氧消化出水中的Na+，并對耦聯系統的可行性進行驗證。同時，考察了培養基中1 000 mg/L Na+對檸檬酸發酵的影響機理，并通過添加碳酸鈣以消除高濃度Na+對檸檬酸發酵的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株與培養基

菌種：黑曲霉(Aspergillusniger)MZ-11，由本實驗室保藏。

土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，MgSO41.5，KH2PO43，瓊脂20，pH調至6.0，115 ℃條件下滅菌20 min。用于黑曲霉菌株的培養和保藏。

1.1.2 試劑

木薯：河南天冠企業集團有限公司提供；玉米：市售玉米粉；(NH4)2SO4、CaCO3、NaOH、Na2SO4：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；液體耐高溫α-淀粉酶(酶活力20 000 U/mL，最適溫度為95～105 ℃，pH 5.5～6.0)：無錫杰能科生物工程有限公司。

1.1.3 儀器與設備

5 L自控發酵罐(LiFlus GX)，韓國生物反應器有限公司；SBA-40B型葡萄糖生物傳感器，山東省科學院生物研究所；電滲析儀，上海大名教育儀器有限公司；組合搖床(HYL-C)，太倉強樂實驗設備有限公司；高效液相色譜儀(Ulti Mate 3000)，美國Dionex公司；分析柱為美國Bio-Rad公司HPX-87 H型離子交換柱；示差折光檢測器(RI-101)，日本Shodex公司。

1.2實驗方法

1.2.1 種子培養

種子培養基：將木薯粉碎并過40目篩，得到木薯粉(淀粉含量為68%～73%，直徑約0.43 mm)，按料水質量比1∶3.6加入去離子水混勻，用體積分數為30%的H2SO4或2 mol/L NaOH溶液調pH至6.0，加入10 U/g液化酶，沸水浴條件下保溫2 h，液化結束冷卻后用去離子水補充液化過程中蒸發的水分，pH調至5.5，加入質量濃度為1 g/L的(NH4)2SO4顆粒作為黑曲霉孢子萌發所需的氮源，按70 mL/L裝液量分裝至1 L錐形瓶中[13]。115 ℃，滅菌20 min。

種子培養方法：將黑曲霉孢子用無菌水洗下，制成濃度為6.0×106個/mL的孢子懸液，混勻后取10 mL孢子懸液接入含有70 mL無菌培養基的1 L錐形瓶中。(36±1)℃，200 r/min條件下，培養21 h。

1.2.2 檸檬酸發酵

發酵培養基：過40目篩的木薯粉和玉米粉(淀粉含量為65%～72%，直徑約0.42 mm)按質量比4∶1混合，并按料水質量比1∶4.5加入工藝用水進行配料，液化操作同種子培養基，pH調至5.5，控制總糖濃度在160 g/L。搖瓶發酵按34 mL裝液量分裝至500 mL錐形瓶中，115 ℃，滅菌20 min。按體積比為15%的接種量接種，發酵條件為(37.5±1)℃、260 r/min，培養92 h。所有搖瓶實驗重復3次。

5 L自控發酵罐發酵裝液量為2 550 mL，添加適量的消泡劑，115 ℃，滅菌20 min。種子液按體積比為15%的接種量接種，循環水浴恒溫裝置保持72 h發酵過程，(37.5±1)℃，600 r/min，通氣量為2 L/min。每隔4 h取樣測定相關參數。

檸檬酸發酵前期pH的調控：在檸檬酸發酵初期(4～24 h)采用蠕動泵勻速自動流加，流速7.5 mL/h，流加的NaOH或H2SO4溶液濃度為2 mol/L，流加總體積為150 mL。在發酵初期將發酵培養基的初總糖濃度提高到170 g/L，以保證流加結束時初總糖濃度與不流加時的總糖濃度(160 g/L)一致。

1.2.3 中溫厭氧消化處理條件

實驗過程是在5 L上流式厭氧污泥床反應器中進行的，反應器溫度控制在(35±1)℃，污泥接種量的體積比為30%，平均COD去除率達到(92.4±2.0)%，平均有機容積負荷和水力停留時間分別為(2.2±0.2) kg/(m3·d)和(8.7±0.9) d。

1.2.4 電滲析處理厭氧消化出水條件

厭氧消化出水在室溫常壓下進行電滲析處理。厭氧消化出水通過進料泵進入電滲析系統，將產生的濃水與進料水混合，以保證淡水的回收率；淡水則收集檢測后回用到檸檬酸發酵。電滲析設備運行條件：電壓15 V，進料水流速50 mL/min；每隔5 min記錄1次系統電流，每隔10 min檢測淡水的電導率和體積；淡水的回收率達到進料水的95%作為實驗的終點，電滲析系統淡水的Na+濃度根據溶液的電導率獲得[14]。

1.3分析方法

總糖測定：樣品用質量分數為4%的HCl于沸水浴中水解2 h，冷卻并調pH后通過SBA-40B型葡萄糖生物傳感器測定[15]。

檸檬酸、葡萄糖和異麥芽糖含量測定：利用高效液相色譜儀進行檢測，操作條件為：流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，柱溫60 ℃。

異麥芽糖酶活力測定[16]：酶活定義為50 ℃，pH為4.5條件下每分鐘消耗1 mg異麥芽糖所需的酶量為1個酶活單位，表示為U/mL。

糖化酶活力測定[17]：酶活定義為50 ℃，pH為4.5條件下每分鐘生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活單位，表示為U/mL。

2 結果與討論

2.15L發酵罐循環過程中檸檬酸發酵參數變化

厭氧消化出水在回用過程中會嚴重抑制檸檬酸發酵，Na+是其中主要的抑制物質。將去離子水作為配料水進行第1批次的檸檬酸發酵，并作為空白對照組。產生的檸檬酸發酵廢水經過中溫厭氧消化系統和電滲析法處理后作為配料水回用。5 L發酵罐中循環實驗一共進行了10批，發酵參數如圖2所示。

圖2 循環過程中檸檬酸發酵參數變化Fig.2 Changes of citric acid fermentation parameters in different recycling batches

循環過程中(2～10批)，平均檸檬酸產量為142.4±2.1 g/L，達到去離子水發酵水平(141.5 g/L)。同時，發酵結束時培養基中的葡萄糖基本被消耗完全，平均殘總糖和殘異麥芽糖質量濃度分別為13.7±0.7 g/L和1.1±0.5 g/L，都低于去離子水發酵水平(分別為17.0 g/L和2.1 g/L)。這表明，采用電滲析方法可以有效去除厭氧消化出水中的高濃度Na+，檸檬酸發酵達到空白對照水平。厭氧消化出水成分較復雜，其中含有色素以及鈣鎂離子等物質，這些物質會吸附或沉淀在電滲析膜表面，造成膜污染，導致處理效果下降[6]。之前的研究中鈣鎂離子可通過空氣吹脫預處理得以去除，但空氣吹脫處理成本較高[18]；此外，采用電滲析法操作復雜同時產生大量二次廢水，不適合大規模工業化應用。因此，需要尋找成本較低、操作簡單的方法，消除厭氧消化出水中的高濃度Na+對檸檬酸發酵的抑制作用。

2.2Na+對檸檬酸發酵過程中培養基pH的影響

1 000 mg/L Na+對檸檬酸發酵過程中培養基pH的影響如圖3所示。去離子水為配料水進行檸檬酸發酵時，培養基pH在發酵前24 h快速下降至3.0以下，之后緩慢下降至發酵結束。當培養基中含有1 000 mg/L Na+時，培養基pH在發酵過程中前24 h同樣快速下降，但下降速率比去離子水發酵更快，pH最大差值達到0.5。

圖3 Na+對檸檬酸發酵過程中培養基pH的影響Fig. 3 Effect of Na+ on medium pH in citric acid fermentation

2.2.1 不同pH對異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響

考察了不同pH對檸檬酸發酵過程中黑曲霉細胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響，結果如表1所示。

表1 pH對黑曲霉細胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶活力的影響

異麥芽糖酶和糖化酶的最適pH值分別為5.5和5.0，此時其活力達到最高，分別為212.69 U/mL和11 702.67 U/mL。隨著pH逐漸下降，異麥芽糖酶和糖化酶的活力顯著降低。結合圖3和表1可知，可能是高濃度Na+的加入導致培養基pH快速下降，造成檸檬酸發酵過程中糖化酶和異麥芽糖酶活力受到抑制，部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，從而檸檬酸產量下降。

2.2.2 流加硫酸溶液對檸檬酸發酵的影響

為驗證上述推論，在去離子水發酵初期(4～24 h)流加2 mol/L H2SO4溶液，結果如圖4所示。在去離子水發酵過程中，培養基pH在前24 h快速下降至3.0以下，之后下降速率變緩。流加2 mol/L H2SO4溶液，培養基pH同樣快速下降，且下降趨勢較空白對照的快，檸檬酸產量為117.3 g/L，較空白對照(141.5 g/L)低(圖4 A和D)。同時，發酵結束時殘總糖和殘異麥芽糖質量濃度分別為35 g/L和13.3 g/L，與培養基中含有1 000 mg/L Na+時的發酵情況基本相同(圖4 B和C)。綜上所述，檸檬酸發酵過程中培養基pH下降過快，確實會導致糊精和異麥芽糖的水解受到抑制，檸檬酸產量大幅度下降。

A- 檸檬酸產量；B - 殘總糖質量濃度；C - 殘異麥芽糖質量濃度；D - 殘葡萄糖質量濃度圖4 在去離子水發酵初期流加硫酸溶液對檸檬酸發酵的影響Fig.4 Effect of sulfuric acid feeding in early stage on citric acid fermentation using deionized water as cooking water

2.2.3 Na+存在條件下流加NaOH溶液對檸檬酸發酵的影響

為進一步驗證上述推論，考察了1 000 mg/L Na+存在條件下，在發酵初期(4～24 h)流加2 mol/L NaOH溶液對檸檬酸發酵的影響，結果如圖5所示。發酵液中含有1 000 mg/L Na+時，培養基pH在發酵前24 h下降較快；流加NaOH溶液后，培養基pH在發酵初期下降速率相對較緩慢，發酵結束檸檬酸產量達到140.3 g/L，接近空白對照(141.5 g/L)水平(圖5A和E)。同時，殘總糖和殘異麥芽糖質量濃度分別為12 g/L和0.1 g/L，都低于空白對照(分別為17 g/L和1.9 g/L)水平(圖5B和C)。此外，發酵結束時葡萄糖基本消耗完全(圖5D)。這表明，在檸檬酸發酵初期流加NaOH溶液，延緩了培養基pH的下降速率，可以有效促進異麥芽糖和糊精的水解，總的可利用糖濃度上升，檸檬酸產量顯著提高。對NaOH溶液流加過程中的糖濃度進行衡算，結果表明殘總糖濃度顯著下降，但檸檬酸產量并沒有相應的增加。經檢測發現在檸檬酸發酵前24 h草酰乙酸水解酶的活力較高，產生了3.7 g/L副產物草酸，較空白對照(0.97 g/L)高。這可能是因為流加NaOH溶液造成發酵初期培養基pH偏高，產生大量草酸。

綜上所述，檸檬酸發酵過程中加入1 000 mg/L Na+會造成培養基pH快速下降，黑曲霉細胞分泌的異麥芽糖酶和糖化酶的活力受到影響，導致異麥芽糖和部分糊精不能有效水解，檸檬酸產量顯著降低。在檸檬酸發酵初期(4～24 h)流加NaOH溶液能基本消除高濃度Na+對檸檬酸發酵的抑制作用，但是，流加NaOH溶液操作較復雜，需要消耗大量的無機試劑，成本較高。此外，該方法會引入大量的Na+，而Na+在循環過程中沒有去除途徑，因此會不斷的積累，影響整個檸檬酸耦聯系統的穩定性。

A-檸檬酸產量；B-殘總糖質量濃度；C-殘異麥芽糖質量濃度；D-殘葡萄糖質量濃度；E-pH圖5 Na+存在條件下在發酵初期流加NaOH溶液對檸檬酸發酵的影響Fig.5 Effect of sodium hydroxide solution feeding in early stage on citric acid fermentation when Na+ existed

2.3Na+存在條件下添加CaCO3對檸檬酸搖瓶發酵的影響

CaCO3是一種常見的、廉價化工原料，成本比NaOH低，且同樣具有調節培養基pH的作用。檸檬酸發酵過程中采用CaCO3調控培養基的pH，引入的Ca2+可以在后期的鈣鹽法提取操作中與檸檬酸形成檸檬酸鈣沉淀，從而被去除，因此不會在循環體系中大量積累，影響耦聯系統的穩定性。

1 000 mg/L Na+存在條件下，添加不同質量濃度CaCO3對檸檬酸發酵的影響如圖6所示。當培養基中含有1 000 mg/L Na+時，檸檬酸發酵受到嚴重抑制，檸檬酸產量僅為117.7 g/L。添加CaCO3的質量濃度小于16 g/L時，隨著CaCO3添加量的增大，發酵結束時，檸檬酸產量逐漸提高，培養基pH逐漸上升，葡萄糖基本消耗完全，殘總糖和殘異麥芽糖濃度逐漸降低。CaCO3添加質量濃度大于20 g/L時，殘總糖、殘異麥芽糖和殘葡萄糖濃度都逐漸上升，檸檬酸產量大幅度下降。當CaCO3添加質量濃度在16～20 g/L時，檸檬酸發酵效果較好，平均檸檬酸產量為139.3±0.1 g/L，較不添加CaCO3時的117.7 g/L提高了18.4%，接近去離子水(空白)發酵水平(141.0 g/L)。同時，平均殘總糖質量濃度為12.8±0.8 g/L，較不添加CaCO3時的33.5 g/L低。此外，殘異麥芽糖和殘葡萄糖基本消耗完全。

注：DV(Difference Value)為殘總糖和殘異麥芽糖的質量濃度之差圖6 Na+存在條件下不同質量濃度CaCO3對檸檬酸發酵的影響Fig.6 Effect of different mass concentrations of calcium carbonate on citric acid fermentation when Na+ existed

培養基中含有1 000 mg/L Na+時，殘總糖和殘異麥芽糖質量濃度的差值(DV)為19.3 g/L，比空白對照(16.7 g/L)高，表明在檸檬酸發酵過程中除了異麥芽糖的水解受到抑制之外，部分糊精的水解也受到抑制。在檸檬酸發酵開始添加CaCO3的質量濃度低于16 g/L時，隨著CaCO3濃度的增加，DV值大幅度下降，說明添加適量的CaCO3促進了培養基中部分糊精的水解。當CaCO3添加質量濃度達到16～20 g/L時，平均DV值為12.1±0.4 g/L，此時培養基中的糊精有效水解為可利用的糖，檸檬酸產量接近空白對照水平。當CaCO3添加質量濃度大于20 g/L時，發酵結束葡萄糖沒有消耗完全，說明黑曲霉細胞活力受到影響，檸檬酸產量顯著降低。

2.45L發酵罐中Na+存在條件下添加CaCO3對檸檬酸發酵的影響

為進一步分析CaCO3的作用，在5 L發酵罐中研究了1 000 mg/L Na+存在條件下，添加18 g/L CaCO3對檸檬酸發酵的影響，結果如圖7所示。培養基中含有1 000 mg/L Na+時，培養基pH在發酵前24 h快速下降至3.0以下，之后緩慢下降直到發酵結束，檸檬酸產量為120.6 g/L，與空白對照相比降低了16.5%(圖7 A)。同時，殘總糖和殘異麥芽糖質量濃度分別為31 g/L和14.1 g/L(圖7 B和C)。檸檬酸發酵開始時添加18 g/LCaCO3，培養基pH在發酵前24 h下降速率變緩，并維持在5.68～2.28，之后其下降趨勢與不添加CaCO3的一致(圖7 E)。發酵結束檸檬酸產量達到139.2 g/L，與不添加CaCO3相比提高了15.4%，接近空白對照(140.5 g/L)。殘異麥芽糖質量濃度為0.3 g/L，遠低于空白對照的1.9 g/L，殘葡萄糖基本消耗完全(圖7 D)。對添加CaCO3發酵過程中的糖濃度進行衡算，結果表明殘總糖濃度下降，但檸檬酸產量沒有相應的增加；由于草酸會與CaCO3反應生成草酸鈣沉淀，故檢測不到草酸含量。經檢測發現添加CaCO3發酵前24 h的草酰乙酸水解酶活力較空白水平高，說明產生了大量副產物草酸。

A-檸檬酸產量；B-殘總糖質量濃度；C-殘異麥芽糖質量濃度；D-殘葡萄糖質量濃度；E-pH圖7 Na+存在條件下添加18 g/L CaCO3對檸檬酸發酵的影響Fig.7 Effect of 18 g/L of calcium carbonate addition on citric acid fermentation when Na+ existed

綜上可知，在1 000 mg/L Na+存在條件下，于檸檬酸發酵開始時添加適量的CaCO3能促進部分糊精和異麥芽糖的水解，總的可利用糖濃度增加，有效減輕了高濃度Na+對檸檬酸發酵的抑制作用，檸檬酸產量大幅度提高。但添加CaCO3會造成培養基中產生大量副產物草酸，降低了原料利用率。

3 結論

本實驗室提出了“檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯系統”以解決檸檬酸發酵行業的廢水排放問題。然而厭氧消化出水成分復雜，Na+是其中主要的抑制物質，若直接回用會嚴重抑制黑曲霉發酵，檸檬酸產量顯著下降。本文采用電滲析法對厭氧消化出水中的高濃度Na+進行去除，循環回用10批后，平均檸檬酸產量達到去離子水發酵水平，驗證了耦聯系統是可行的。研究表明，高濃度Na+會造成發酵前期培養基pH快速下降，糖化酶和異麥芽糖酶活力受到抑制，導致部分糊精和異麥芽糖不能有效水解，最終造成檸檬酸產量顯著降低。在檸檬酸發酵開始時添加CaCO3可以延緩發酵初期培養基pH的下降速率，但會造成培養基pH較高，使得草酰乙酸水解酶活力升高，導致副產物草酸大量積累，而檸檬酸產量仍低于去離子水發酵。因此，在后續的研究中可通過添加草酰乙酸水解酶抑制劑，或采用基因工程手段，對表達草酰乙酸水解酶的相關基因進行敲除，從而減少或消除草酸的產生，為實現耦聯系統的工業化應用提供理論依據。

[1] DHILLON G S, BRAR S K, VERMA M, et al. Recent advances in citric acid bio-production and recovery[J]. Food & Bioprocess Technology, 2011, 4(4): 505-529.

[2] AMBATI P, AYYANNA C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2001, 17(4): 331-335.

[3] DAROUNEH E, ALAVI A, VOSOUGHI M, et al. Citric acid production: Surface culture versus submerged culture[J]. African Journal of Microbiology Research, 2009, 3(9): 541-545.

[4] 孟佼, 周平平, 張建,等. 玉米秸稈水解液的黑曲霉發酵生產高濃度檸檬酸[J]. 華東理工大學學報(自然科學版), 2014, 40(6):681-683.

[5] LI C, YANG H, XIA X, et al. High efficient treatment of citric acid effluent byChlorellavulgaris, and potential biomass utilization[J]. Bioresource Technology, 2013, 127(127C): 248-255.

[6] Xu J, SU X F, BAO J W, et al. Cleaner production of citric acid by recycling its extraction wastewater treated with anaerobic digestion and electrodialysis in an integrated citric acid-methane production process[J]. Bioresource Technology, 2015, 189: 186-194.

[7] COLLERAN E, PENDER S, PHILPOTT U, et al. Full-scale and laboratory-scale anaerobic treatment of citric acid production wastewater[J]. Biodegradation, 1998, 9(3):233-245.

[8] 王柯. 酒精—沼氣雙發酵耦聯生態系統的機理和關鍵技術研究[D]. 無錫:江南大學, 2014.

[9] ZHI X, YANG H, BERTHOLD S, et al. Potential improvement to a citric wastewater treatment plant using bio-hydrogen and a hybrid energy system[J]. Journal of Power Sources, 2010, 195(19): 6 945-6 953.

[10] XU J, CHEN Y Q, ZHANG H J, et al. Production of citric acid using its extraction wastewater treated by anaerobic digestion and ion exchange in an integrated citric acid-methane fermentation process[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2014, 37(8): 1 659-1 668.

[11] 陳陽秋, 徐健, 張宏建,等. 檸檬酸-沼氣雙發酵耦聯工藝中鈉離子的影響[J]. 安全與環境學報, 2016(5): 221-226.

[12] XU J, CHEN Y Q, ZHANG H J, et al. Establishment and assessment of an integrated citric acid-methane production process[J]. Bioresource Technology, 2015, 176: 121-128.

[13] ZHANG H J, ZHANG J H, XU J, et al. A novel recycling process using the treated citric acid wastewater as ingredients water for citric acid production[J]. Biochemical Engineering Journal, 2014, 90(5): 206-213.

[14] SADRZADEH M, GHADIMI A, MOHAMMADI T. Coupling a mathematical and a fuzzy logic-based model for prediction of zinc ions separation from wastewater using electrodialysis[J]. Chemical Engineering Journal, 2009, 151(1-3):262-274.

[15] 綦峰, 張宏建, 徐健,等. 檸檬酸厭氧出水回用技術初探[J]. 食品與發酵工業, 2013, 39(6):76-80.

[16] NAIR S U, SINGHAL R S, KAMAT M Y. Induction of pullulanase production inBacilluscereusFDTA-13[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(4): 856-859.

[17] 孫繼祥. 黑曲霉產糖化酶液態發酵條件研究[J]. 釀酒科技, 2011(10): 42-47.

[18] XU J, CHEN Y Q, ZHANG H J, et al. Optimization of the integrated citric acid-methane fermentation process by air stripping and glucoamylase addition[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2014, 38(3): 411-420.

Explorationofeffectofsodiumionsoncitricacidfermentationwithintegratedcitricacid-methanefermentationsystemanditsremoval

BAO Jia-wei,XU Jian, SU Xian-feng, ZHANG Hong-jian, MAO Zhong-gui*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

To solve the potential extraction wastewater pollution in citric acid production, an integrated citric acid-methane fermentation system was proposed. In this system, the extraction wastewater was treated through mesophilic anaerobic digestion (AD) and then the anaerobic digestion effluent was further treated and recycled to make mash for the next batch of citric acid fermentation, thus the wastewater discharge was eliminated. Excessive Na+contained in AD effluent was confirmed to be the major inhibitor for citric acid fermentation and its concentration could accumulate to 1 000 mg/L in recycling. AD effluent was treated with electrodialysis system to remove sodium and then recycled to make mash for the next batch of the citric acid fermentation. The recycling was performed for 10 batches andthe average citric acid production was 142.4 ±2.1 g/L,which was comparable to that of the fermentation with tap water (141.5 g/L).Effect of high concentration of sodium on the citric acid fermentation was investigated and the results indicated that 1 000 mg/L Na+contained in citric acid fermentation could decline the medium pH sharply at initial stage, which decreased the activity of isomaltase and glucoamylase secreted byAspergillusniger, and influenced the breakdown of isomaltose and part of other dextrins, thus caused the decrease of citric acid production. 18 g/L calcium carbonate was added to medium at the start of the citric acid fermentation,the decline rate of the medium pH slowed down, which could promote the breakdown of isomaltose and part of other dextrins, and thus could increase available sugar concentration and relieve the inhibition caused by 1 000 mg/L Na+.However,as the medium pH maintained at the high level because of the calcium carbonate addition, part of available sugar was converted to by-product oxalic acid and the citric acid production was 139.2 g/L, which was still lower than that of the fermentation with tap water.

citric acid; anaerobic digestion; calcium carbonate; sodium ions; isomaltase; glucoamylase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013727

碩士研究生(毛忠貴教授為通訊作者,E-mail: maozg@jiangnan.edu.cn)。

2016-12-14，改回日期：2017-02-20