哈薩克傳統發酵食品中乳酸菌的分離鑒定及代謝特性研究

翟磊，凌空，宋振，姚粟，程池，楊玉新*

1(新疆中亞食品研發中心(有限公司)，新疆 烏魯木齊，830001) 2(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

哈薩克傳統發酵食品中乳酸菌的分離鑒定及代謝特性研究

翟磊1，2，凌空2，宋振1，姚粟2，程池2，楊玉新1*

1(新疆中亞食品研發中心(有限公司)，新疆 烏魯木齊，830001) 2(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)

采用純培養方法從哈薩克傳統發酵駱駝奶、馬奶子和奶酪中分離得到11株乳酸菌。通過16S rRNA基因序列和pheS基因序列系統發育學分析，并結合形態特征和生理生化特性，確定這些乳酸菌的分類學地位。通過測定乳酸菌的耐酸耐鹽特性、產酸特性、降解亞硝酸鹽能力、氨基酸脫羧酶活力及抑菌能力，篩選得到了3株具有潛在生產應用價值的乳酸菌，即LactobacillusparacaseiKCH3 (CICC 6277)，LactobacillusfermentumKM1 (CICC 6278)和LactobacillusfermentumKC3 (CICC 6290)，為果蔬發酵應用奠定了菌種基礎。

哈薩克傳統發酵食品；乳酸菌；多相分類學鑒定；代謝特性

哈薩克傳統發酵食品的制作和食用歷史悠久，風味獨特，營養豐富，而經過長時間的自然馴化，這些傳統發酵食品中一些具有優良特性的乳酸菌保留了下來，在發酵食品過程中起到了重要作用[1]。乳酸菌主要包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterialsp.)、鏈球菌屬(Streptococcussp.)、乳球菌屬(Lactococcussp.)以及腸球菌屬(Enterococcussp.)等[2]。目前研究表明，乳酸菌可以對人體產生健康的功效，攝入一定量的乳酸菌可以促進有益微生物的生存，抑制有害微生物的生長，從而保持腸道內菌群的平衡，減少腸道疾病的發生[3-4]，同時由于乳酸菌在生長過程中會合成維生素、產生有機酸、膽鹽水解酶(BSH)、胞外蛋白水解酶、肽水解酶、細菌素等多種物質，還具有減緩乳糖不耐癥、降膽固醇、抑制和預防腫瘤、延緩人體衰老等有益功能[5-7]。

本研究采用多相分類技術對分離于哈薩克傳統發酵駱駝奶、馬奶子和奶酪中的乳酸菌進行了鑒定，明確其分類學地位。在此基礎上，從耐酸耐鹽特性、產酸能力、抑菌能力、降解亞硝酸鹽能力和氨基酸脫羧酶能力等方面對乳酸菌的生長代謝特征進行測定分析，篩選得到了3株具有潛在生產應用價值的乳酸菌，為乳酸菌在果蔬發酵中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 實驗材料

1.1.2 實驗菌株

大腸桿菌 O157:H7 (Escherichiacoli, CICC 10907)，腸沙門氏菌 (Salmonellaenteric, CICC 10871)，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, CICC 10790) 和單增李斯特菌 (Listeriamonocytogenes, CICC 21635) 均來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 實驗試劑

MRS培養基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、革蘭氏染色試劑盒和生理生化鑒定管，北京陸橋技術有限公司；API試劑條，生物梅里埃公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，OMEGA公司；GoldView，北京賽百盛基因技術有限公司；溶菌酶，Sigma公司、蛋白酶，Merk公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker，天為時代生物有限公司。

1.1.4 實驗設備

光學顯微鏡Olympus BH-2，奧林巴斯有限公司；pH計FE20，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；紫外分光光度計7200，尤尼科(上海)儀器有限公司；溫度梯度PCR儀，Biometra公司；恒溫培養箱BHG-8082型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

利用梯度稀釋涂布和平板劃線法對哈薩克駱駝奶、馬奶子和奶酪中的乳酸菌進行分離純化[8-9]，3次分離純化后的乳酸菌于-80℃冰箱甘油冷凍保藏。

1.2.2 乳酸菌多相分類學鑒定

通過分子生物學(16S rRNA基因序列測定及pheS基因序列分析)，結合表型特征(革蘭氏染色、接觸酶試驗和API 50 CHL試驗)，對分離篩選的乳酸菌進行多相分類學鑒定。其中利用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取上述菌株的基因組DNA，操作步驟參見試劑盒說明書，API 50 CHL試驗按照梅里埃產品操作說明進行操作。

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組。利用引物27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 對16S rRNA基因進行擴增。PCR反應體系為：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL, 補充去離子水至50 μL。反應條件[10]: 94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，52℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33個循環，72 ℃ 7 min。PCR產物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。利用引物21f (5’-CAYCCNGCH CGYGAYATGC-3’)和23r(5’-GGRTGRACCATVCCNGCHCC-3’)對pheS基因序列進行擴增。PCR反應體系同上，反應條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min，46℃ 2min 15 s，72℃ 1min 15 s，3個循環；95℃ 1 min 15 s，46℃ 1 min 15 s, 72℃ 1 min 15 s，30個循環；72℃ 7 min。

將測序結果在GenBank數據庫中進行比對分析，以確定其與模式菌種的同源關系。確定并下載各模式菌種的有效序列后，采用ClustalX 1.83進行多序列比對后,使用MEGA 5.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)進行系統發育分析[11]。

鉛是一種有毒元素，土壤中過量的鉛通過生物地球化學循環進入植物和人體后，可使生物體產生不同的慢性和急性中毒現象[19]。

1.2.3 乳酸菌耐酸試驗

挑取MRS培養基上生長的單菌落于4 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養18 h后，按1%接種量分別接入pH2、3、4、5、6和7的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養48 h，測定620 nm下吸光值(OD620)，并記錄結果[12]。

1.2.4 乳酸菌耐鹽試驗

挑取MRS培養基上生長的單菌落于4 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養18 h后，按1%接種量接入分別含20%、40%、60%、80%和100 g/L NaCl的MRS液體培養基中，37℃靜置培養48 h，測定620 nm下吸光值(OD620)，并記錄結果[13]。

1.2.5 乳酸菌生長曲線及產酸能力測定

挑取MRS培養基上生長的單菌落于4 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養18 h后，按1%接種量接種于MRS液體培養基中培養，以不接種培養基作為對照，每隔2 h取樣測定620 nm下吸光值(OD620)。同時每隔4 h取出部分發酵液通過pH計直接測定pH值[7, 14]。

1.2.6 乳酸菌亞硝酸鹽降解能力測定

挑取MRS培養基上生長的單菌落于4 mL MRS液體培養基中，37℃靜置培養18 h后，按1%接種量接種于含125 μg/mL NaNO2的200 mL MRS液體培養基中37 ℃培養，每隔24 h定時取樣測定NaNO2含量。參考GB/T 5009.33—2003中的鹽酸萘乙二胺法進行測定，不接種的MRS培養基(含125 μg/mL NaNO2)作為空白對照[15]。

1.2.7 乳酸菌氨基酸脫羧酶試驗

挑取MRS培養基上生長的單菌落于3 mL無菌生理鹽水中研磨，制備成0.5麥氏濁度懸液，分別滴入氨基酸脫羧酶試驗的安培瓶中，每瓶3滴，并加無菌液體石蠟覆蓋培養基表面，培養24 h后，觀察試驗管與對照管顏色變化，試驗管為紫色，對照管為黃色，結果為陽性；試驗管與對照管均為黃色，結果為陰性。

1.2.8 乳酸菌抑菌性研究

采用濾紙片法測定目標菌株的抑菌性能。挑取新鮮培養的指示菌株大腸桿菌 O157:H7 (Escherichiacoli, CICC 10907)，腸沙門氏菌 (Salmonellaenteric, CICC 10871)，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, CICC 10790) 和單增李斯特菌 (Listeriamonocytogenes, CICC 21635)，將菌懸液濃度調至0.5麥氏濁度并均勻涂布在TSA培養基上，然后將濾紙片浸泡在200 μL培養24 h的乳酸菌發酵液中，置于上述培養基中，37℃培養箱中培養48 h，記錄結果[8, 16]。

2 結果與分析

2.1乳酸菌的分離純化

從MRS平板上挑取11個形態有差異的菌落進行劃線純化菌種，命名為KM1、KM2、KM3、KM4、KC1、KC2、KC3、KC4、KCH1、KCH2和KCH3(表1)，經3次分離純化后加到20%甘油中，保藏于-80℃冰箱供后續實驗使用。

2.2乳酸菌多相分類學鑒定

革蘭氏染色以及接觸酶試驗表明11株菌株均為革蘭氏陽性，接觸酶陰性菌株，符合乳酸菌的特征(表1)。16S rRNA基因系統發育分析表明11株菌株均屬于乳酸菌，其中菌株KC2、KM2和KM3與德氏乳桿菌的同源性均在99.37%以上，且與其他近種的同源性均在98.65%以下，鑒定為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)。菌株KC3、KC4和KM1與發酵乳桿菌的同源性為99.85%，且與其他近種的同源性均在98.65%以下，鑒定為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。菌株KCH1和KCH2與乳酸乳球菌的同源性均在99.42%以上，且與其他近種的同源性均在98.65%以下，鑒定為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。其余3株菌株只能鑒定到屬水平(圖1A)。對于16S rRNA基因序列只能鑒定到屬水平的菌株進行pheS基因序列系統發育分析。結果表明，菌株KC1和KM4與唾液鏈球菌嗜熱亞種的同源性為99%，可鑒定為唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariussubspthermophilus)。菌株KCH3與干酪乳桿菌和類干酪乳桿菌的同源性較近，只能鑒定到乳桿菌屬(圖1B)，對其進行API 50 CHL試驗，鑒定結果表明菌株KCH3鑒定為類干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)(表2)。分離鑒定的11株乳酸菌均已保藏于中國工業菌種保藏管理中心(表1)。

表1 分離鑒定的乳酸菌信息統計

2.3乳酸菌耐酸耐鹽實驗

耐酸試驗結果表明，隨著pH值降低，乳酸菌的生長受到明顯的抑制。其中菌株KC3、KM1和KCH3展現了較強的耐酸能力，其中菌株KC3和KM1在pH 3 條件下OD620值能夠達到0.2左右，而其他菌株幾乎不生長，其中菌株KC3和KM1在pH4的條件下的OD620值可以達到0.6。而菌株KM4和KC1耐酸能力最弱，不能在pH 4的環境下生長，在pH 5、6和7的環境中生長也較弱(圖2A)。

(A)：16S rRNA基因 (B)：pheS基因圖1 分離鑒定的乳酸菌系統發育樹 Fig.1 The phylogenetic trees of isolated and identified注：采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株與相關模式種系統發育樹，進行1000次的相似度重復計算，圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值，上標的“T”表示模式菌株。

耐鹽試驗結果表明，乳酸菌的生長與NaCl濃度成反比，即隨著NaCl濃度的升高，乳酸菌的生長受到明顯的抑制(圖2B)。大部分菌株在2%的NaCl下可以正常生長，但KM2、KM4、KCH1和KCH2幾乎不生長。而菌株KCH3的耐鹽能力最強，在6%NaCl條件下，OD620值可以達到0.35。菌株KM1和KC3能夠耐受4%的NaCl。綜合分析乳酸菌的耐酸和耐鹽能力，選取菌株KC3、KM1和KCH3進行后續生長代謝特性研究。

2.4乳酸菌的生長曲線和產酸能力測定

生長曲線測定表明，菌株KC3和KM1進入對數期較快，都在4 h進入對數期，分別在12 h和16 h進入穩定期，而KCH3在14 h最晚進入對數期(圖3A)。產酸能力測定結果表明，菌株KC3產酸速度最快，pH值可以降到4.0，菌株KM1和KCH3產酸速度次之，pH值可以降到4.2和3.8(圖3B)。由此可見，菌株進入對數期越快，其產酸速率也較快。

2.5乳酸菌亞硝酸鹽降解能力測定

試驗結果表明隨著培養時間的延長，菌株降解的亞硝酸鹽能力越強。培養24 h后，KC3和KM1的亞硝酸鹽降解率分別可達到85.4%和81.3%，而KCH3的亞硝酸鹽降解率只有43.7%。培養48 h后，3株的亞硝酸鹽降解率均可以達到100%(表3)。

表2 菌株KCH3碳源利用特征

注：“+”，陽性；“-”，陰性。

(A): 耐酸特性； (B): 耐鹽特性圖2 分離鑒定的乳酸菌耐酸耐鹽特性 Fig.2 Acid- and salt-resistance properties of isolated and identified lactic acid bacteria

(A): 生長特性；(B): 產酸特性圖3 分離鑒定的乳酸菌的生長和產酸特性 Fig.3 Growth and acid production of isolated and identified lactic acid bacteria

2.6乳酸菌氨基酸脫羧酶試驗

氨基酸脫羧酶試驗測定結果表明，菌株KC3和KM1對精氨酸雙水解脫羧酶活性顯陽性，剩余菌株對4種氨基酸脫羧酶活性均顯陰性(表3)。

表3 分離鑒定的乳酸菌表型特性

注：“a”表示菌株培養24 h后的亞硝酸鹽降解率，“b”表示菌株培養48h后的亞硝酸鹽降解率；“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.7乳酸菌抑菌能力測定

由抑菌能力實驗結果可知，3株乳酸菌均能夠抑菌腸炎沙門氏菌和大腸桿菌，其中KCH3的抑菌作用最大，對于腸炎沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌直徑可達到20 mm和10 mm，對金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌無抑菌作用(表3)。

3 討論

通過多相分類學鑒定，從哈薩克傳統發酵食品中共篩選到3個屬，11株乳酸菌。其中發酵乳桿菌和德氏乳桿菌各3株，嗜熱鏈球菌和乳酸乳球菌各2株，副干酪乳桿菌1株。從菌株來源看，哈薩克駱駝奶中和馬奶子中含有相同種類的乳酸菌，有發酵乳桿菌、德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌。而奶酪中含有乳酸乳球菌和副干酪乳桿菌。由此可見，不同來源的哈薩克傳統發酵食品中既含有相同乳酸菌又各具特色(圖4)。

圖4 分離鑒定的乳酸菌的種類和來源Fig.4 Classification and origin of isolated and identified lactic acid bacteria

ARGYRI[2]等認為乳酸菌對低酸環境和滲透壓的耐受性也是作為發酵劑和潛在益生菌的必要條件。BEGANOVIC[11]對篩選到的菌株進行4%～6% NaCl的耐鹽試驗，優良菌株的OD600值在0.4到0.6之間。HWANHLEM[17]中通過實驗得到菌株產酸可以使pH值降至4.3～4.6，認為乳酸可以導致革蘭氏陰性病原菌外膜的損傷，引起病原菌LPS層的破壞從而導致的亞致死損傷。AMMOR[18]等認為乳酸菌快速產酸形成的低酸環境可以抑制有害菌群的繁殖從而提升產品的安全性及貨架期。本研究中篩選得到的菌株KC3和KM1在pH4的條件下的OD620值可以達到0.6，菌株KCH3在6%NaCl條件下的OD620值可以達到0.35，展現了良好的耐酸和耐鹽能力，為后續的果蔬發酵試驗奠定了菌種基礎。

亞硝酸鹽及生物胺的含量也是乳酸菌進行果蔬發酵考慮的因素。攝取過量的亞硝酸鹽會引起致癌、抵抗甲狀腺素和引起智障等危害[19]。菌株KCH3、KC3和KM1培養48 h后亞硝酸鹽的降解率分別可達100%，高于目前報道的乳酸菌[20]。

生物胺是一種有害物質，如果健康人群攝入大量生物胺，或易感人群攝入少量生物胺，生物胺能進入機體各組織系統，導致腎上腺素和胃酸過量分泌、心跳加快、血糖含量增加或血壓升高等癥狀[21]。篩選氨基酸脫羧酶陰性的乳酸菌能夠大大降低果蔬發酵中生物胺的含量，進一步提高產品的安全性。菌株KCH3的4種氨基酸脫羧酶均為陰性，并且對3種有害菌的均有抑菌作用，將其應用于果蔬發酵，能夠進一步提高產品的安全性。

通過功能篩選，獲得了3株具有潛在生產價值的乳酸菌，即LactobacillusparacaseiKCH3 (CICC 6277)，LactobacillusfermentumKM1 (CICC 6278)和LactobacillusfermentumKC3 (CICC 6290)，為果蔬發酵應用奠定了菌種基礎。

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Isolation,identificationandcharacterizationoflacticacidbacteriafromtraditionalfermentationfoodsinKazak

ZHAI Lei1,2, LING Kong2, SONG Zhen1, YAO Su2, CHENG Chi2, YANG Yuxin1*

1(Xinjiang Central Asia Food Research and Development Centre, Urumchi 830001,China) 2(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100027,China)

Eleven lactic acid bacteria were isolated from traditional fermentation foods including camel milk, mare milk and cheese in Kazak by culture-dependent methods. These isolates were identified by 16S rRNA gene andpheS gene sequences phylogenetic analysis, combined with morphology and physiological and biochemical characteristics. The abilities of acid- and salt-resistance, acid production, nitrite degradation, amino acids decarboxylases and antimicrobial properties were detected to screen lactic acid bacteria with potential applications. As a result, three lactic acid bacteria designated asL．paracaseiKCH3 (CICC 6277),L．fermentumKM1 (CICC 6278) andL．fermentumKC3 (CICC 6290) were obtained and laid a foundation for vegetable fermentation application.

traditional fermentation food in Kazak; lactic acid bacteria; polyphasic taxonomy identification; metabolic properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013447

博士(楊玉新工程師為通訊作者，E-mail: zhailei@china-cicc.org)。

“十三五”科技計劃國家重點研發計劃 (No. 2016-YFD0400502)；國家微生物資源平臺專項 (No. NIMR-2016-4)；自治區科技支疆項目 (No. 2016E02021)

2016-11-20,改回日期：2017-04-25