南疆傳統發酵酸奶中可產生生物膜乳酸菌的篩選及鑒定
2017-09-03 09:42:10西熱娜依阿布力克木穆耶賽爾玉蘇普努爾古麗熱合曼
食品與發酵工業 2017年7期
西熱娜依·阿布力克木，穆耶賽爾·玉蘇普，努爾古麗·熱合曼
(新疆師范大學 生命科學學院，新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊，830054)
南疆傳統發酵酸奶中可產生生物膜乳酸菌的篩選及鑒定
西熱娜依·阿布力克木，穆耶賽爾·玉蘇普，努爾古麗·熱合曼*
(新疆師范大學 生命科學學院，新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊，830054)
為了探索新疆長壽地區傳統發酵酸奶中優勢乳酸菌的生物膜形成能力，采用純培養法、96 孔微量板定量檢測法、掃描電子顯微鏡觀察法及16S rRNA基因序列分析法，對3份阿圖什和1份烏什傳統發酵酸奶中可產生生物膜的乳酸菌進行了篩選、分子鑒定及生物膜結構圖片觀察。最終從4份樣品中分離出57 株乳酸菌，其中38 株(73.68%)乳酸菌均有不同程度的生物膜形成能力，16 株(28.07%)乳酸菌為強黏附成生物膜菌株、22 株(38.59%)為中等黏附成生物膜菌株。分子鑒定實驗結果顯示，可形成生物膜的乳酸菌共有3 個屬、6 個種，其中16 株為Enterococcusdurans、1 株為Enterococcusfaecium、7 株為Enterococcusthailandicus、3 株為Enterococcuslactis、6 株為Lactobacillusplantarum、5 株為Streptococcusthermophilus。可產生生物膜乳酸菌中腸球菌(Enterococcus)為優勢菌屬，其次為乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)。
乳酸菌；生物膜；電子顯微鏡
新疆為多民族居住的重要的牧業基地，地理位置獨特，不同地區氣候差異較大。這里的少數民族千百年以來食用以傳統方法制作的酸奶，酸奶中有芳香物質、壁外多糖、多種乳酸、乳糖、氨基酸、礦物質、維生素、酶等營養物質，營養價值甚至超過純牛奶[1]。酸奶里面營養物質豐富、促進調節腸道微生態、可以有效地降低膽固醇、抗衰老、在人體健康中起著重要作用[2]。
不同的民族特色發酵乳制品中均蘊含著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌能夠產生多種有益的代謝產物，例如乳酸、細菌素、胞外多糖等。胞外多糖是分泌于細胞外的一類糖類化合物，它對改善發酵乳制品的組織狀態起著重要作用[3]。胞外多糖(EPS)的存在有利于細胞與細胞之間的黏附及生物膜的形成和成熟、使細胞免受惡劣環境的影響[4]，即作為生物膜形成中關鍵的組成部分[5]。
生物膜(Biofilm)指細菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，是微生物在宿主體內形成的一種具有復雜結構并附著在宿主表面的微生物群落[6]。乳酸菌生物膜黏附定居在人體腸道并起益生作用，在連續接種等發酵工業中也具有十分重要的意義。
截至目前為止，關于新疆各地區酸奶中篩選出可產生物膜乳酸菌的研究較少。任曉鏷等探索能誘導植物乳桿菌形成生物膜的外界環境因素[7]。本實驗采用純培養法、96 孔微量板定量檢測法、掃描電子顯微鏡觀察法及16S rRNA基因序列分析法，對3份阿圖什和1份烏什傳統發酵酸奶中可產生生物膜乳酸菌進行了篩選、分子鑒定及生物膜結構圖片觀察。
1 材料與方法
1.1實驗材料
樣品來源：從居住于新疆阿圖什、烏什等地區的農民家庭采集4份樣品，樣品詳細信息見表1。
表1 樣品采集信息表
樣品采集：用無菌吸管將樣品吸取并立刻裝在50 mL無菌離心管中，用封口膜緊密包裝并立即裝在冰袋中運輸到實驗室。
改良MRS培養基、 改良Lee氏培養基[8]。
1.2儀器與設備
LRH-250生化培養箱，上海一恒科技有限公司；光學顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；PCR儀、凝膠成像系統、離心機、振蕩培養箱，上海天呈實驗儀器制造有限公司； 96 孔平底培養板、酶標儀，基因有限公司；掃描電鏡(JSM-6390)，日本JEOL公司。
1.3方法
1.3.1 乳酸菌的分離及染色鏡檢
先取4.5 mL 無菌生理鹽水分別裝入7個試管里，再取500 μL酸奶加入第1個試管充分混勻，按稀釋梯度法準備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，接著依次取100 μL稀釋度為 10-5、10-6、10-7的樣品，涂布改良MRS、Lee氏培養基瓊脂平板，最后把MRS、Lee氏平板放于37 ℃培養48 h[9]。培養完畢后菌落根據于MRS平板上是否有明顯的容鈣圈以及Lee氏培養基顏色是否由紫色變為黃色等特征來挑取。形態不同的菌落再純化培養幾次，至到菌落形態一直為止(以染色鏡檢法判斷是否純化)。最后通過過氧化氫酶、革蘭氏染色等試驗來篩選并初步鑒定乳酸菌。
1.3.2 96孔微量板定量檢測法篩選可產生生物膜的菌株
1)通過分離純化得到的乳酸菌于37 ℃條件下靜置培養48 h后，取菌懸液1 μL加入裝有MRS液體培養基(100 μL/孔)的標準96 孔微量滴定板進行培養48 h，以未接菌的MRS培養基為空白對照。
2)培養完成后用酶標儀測定培養物于波長為630 nm處的光密度值OD1，接著棄去原培養基并以蒸餾水洗滌除去浮游狀態的菌(重復進行3～4次)，96 微孔板置于室溫干燥2 h。
3)取100 μL 1%結晶紫溶液依次加入每個孔，染色20 min后用蒸餾水去除孔壁染液(重復進行4～5次)并將96微孔板置于室溫干燥30 min。
4)每孔中依次加入100μL 95%乙醇，同時微量振蕩30 min。最后采用酶標儀測定OD630 nm處的 OD2。 做3次平行實驗。
(1)
(2)
OD1c，OD2c為空白對照吸光度值，B<0.1為不黏附成膜，B≥0.1為黏附成膜，0.1
1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察生物膜結構
無菌六孔板內放置無菌蓋玻片，按比例為1∶100接種乳酸菌后37 ℃條件下靜置培養48 h。將培養皿用0.1% PBS(pH 7.2)洗3次，每次5 min，以處理未粘附菌，再加4%戊二醛固定液固定并過夜。以0.1 mol/L PBS 沖洗培養皿，加1%四氧化鋨固定2 h (20 ℃)，以0.1 mol/L PBS再洗2次。最后每隔10 min于50%、70%、80%、90%、100%乙醇系列中脫水后通過JFD-320冷凍干燥儀干燥5 min，真空噴金，并于掃描電鏡(JSM-6390，日本JEOL公司)下拍照[13-14]。
1.3.4 16S rRNA 基因序列分析
采用TIAN GEN 細菌基因組DNA提取試劑盒，對具有生物膜形成能力的菌株進行16S rRNA基因序列分析。以成功提取的DNA 為細菌模板進行PCR擴增。16S rRNA 基因序列擴增設計引物：上游引物為27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；下游引物為1495r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)[15-16]。擴增循環為94 ℃，5 min；(94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1．5 min；30個循環)；72 ℃，5 min[17]，擴增體系見表2。擴增完成后，取6 μL PCR產物和3 μL溴酚藍，混合點樣1.0%瓊脂糖凝膠電泳來確認PCR產物質量，以在1 500 bp左右出現清晰的條帶為對照。擴增產物由上海生工有限公司測序。
表2 16S rRNA基因序列 PCR擴增體系
PCR擴增產物送給上海生物工程有限公司進行測序。待測菌測序序列后提交到GenBank，采用Blast程序與己知序列進行相似性比對分析。GenBank將按照與測得序列的相似性高低列出己知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類。最后采用Mega7.0軟件繪制出(Neighbor-Joining)系統發育樹，因而對所可形成生物膜菌進行鑒定。
2 結果與分析
2.1乳酸菌的分離純化
根據改良MRS 及Lee氏平板上是否有明顯的溶鈣圈及顏色是否變成為黃色等2種實驗結果隨機挑取并純化菌落，通過簡單染色確認是否已純化，最后4個樣品從不同稀釋度中篩選出57 個菌落。用光學顯微鏡來觀察細胞形態，部分菌株形態結果如圖1，有短桿狀，長桿狀，球狀，連球狀，表面光滑，半透明或不透明，凸起，邊緣整齊等。最后實驗結果顯示，這57 株菌均為接觸酶陰性、革蘭氏陽性，初步鑒定為乳酸菌。
圖注：13為球狀菌；111為鏈球狀菌；120為短桿狀菌圖1 傳統發酵酸奶中乳酸菌細胞形態(放大×100)Fig．1 The morphology of lactic acid bacteria in fermented milk
2.2篩選具有生物摸形成能力的乳酸菌
菌株根據生物膜形成能力分成4組：B<0.1為不黏附成膜，B≥0.1為黏附成膜，0.1
表3 分離菌株根據生物膜形成能力分組
圖2 阿圖什酸奶中可形成生物膜的菌株Fig.2 Biofilm formation ability of LAB in Atux fermented milk
圖3 烏什酸奶中可形成生物膜的菌株Fig.3 Biofilm formation ability of LAB in Uqturpan fermented milk
A-28號株；B-76號株；C-M63株；D-132號株；E-L5株；F-L2株圖4 生物膜電子顯微鏡圖片Fig.4 Biofilm picture of electron microscophy
2.3掃描電子顯微鏡觀察生物膜結構
掃描電鏡可以直接觀察生物膜結構。本研究利用掃描電子顯微鏡，對強黏附成膜乳酸菌代表菌株(28；76；M63)，中等強度黏附成膜乳酸菌代表菌株(132；L5)及不黏附成膜乳酸菌代表菌株(L2)進行電鏡拍照。由圖4可知， A 、B、C等強黏附成膜乳酸菌菌落相互聚集，表面細菌密集，菌落增厚，聚集成團，形成大塊的生物膜。D、E等中等強度黏附成膜乳酸菌中少部分開始粘附聚集并開始包裹在代謝產物中，菌落之間間隙較大，而不黏附成膜乳酸菌代表菌株(F)菌細胞黏附很少，與中、強黏附成膜乳酸菌相比具有顯著的差異。
2.416SrRNA分子鑒定
對38株可產生生物膜乳酸菌16S rRNA基因序列進行擴增鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠，將擴增產物進行電泳檢測，以1 500 bp左右出現清晰的條帶為準。采用DNAStar 4.0軟件，對待測菌株的16S rRNA基因序列進行整理，并將得到的有效序列提交到GenBank，采用Blast程序與己知序列進行相似性比對。結果顯示，38株菌16S rRNA 基因序列同源性均≥99%。相似度及分離菌株在GenBank中的登錄號見表4。
表4 可產生生物膜乳酸菌16S rDNA序列與GenBank數據庫中相關序列相似性分析
最后，采用MEGA7.0 軟件繪制(Neighbor-Joining)系統發育樹(系統發育樹見圖5)。結果表明，所可產生生物膜菌株歸屬于3 個屬6 個種，其中3個屬分別是腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球屬 (Streptococcus)，6個種分別為耐久腸球菌 (E.durans)、屎腸球菌 (E.faecium)、E.thailandicus、Enterococcuslactis、植物乳桿菌(L.Plantarum)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)。
圖5 乳酸菌(可形成生物膜)的16S rRNA 基因序列系統發育樹 Fig.5 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of biofilm forming LAB
由圖5可知， M55、32、24、2、27、23 、M63、L15、M65、M64、M62、M59、M58、M57、M56、22與標準菌株Enterococcusduransstrain98D(T)相似性100%或99%，將其鑒定為Enterococcusdurans。34、28、70、9、8、L5、29與標準菌株Enterococcusthailandicus聚為一類，且相似度均為99%,所以歸屬于Enterococcusthailandicus。37 與EnterococcusfaeciumDSM 20477(T) 相似度是100%，并在進化樹上同支上，將其鑒定為Enterococcusfaecium。L22 、L20、71與標準菌株EnterococcuslactisBT159(T)在同支上，并相似度分別為99%，因此鑒定為Enterococcuslactis。菌株107、120、129、131、132、134與標準菌株LactobacillusplantarumJCM 1149聚為一類并相似性均為100%，將其鑒定為Lactobacillusplantarum。 菌株3、7、17、76、L24與標準菌株StreptococcusthermophilusATCC 19258(T) 聚為一類并相似性均為100%，將其鑒定為Streptococcusthermophilus。
3 討論
研究發現，在食品表面上形成益生菌生物膜可以有效地改善其表面的物理化學特性，并能抑制不良浮游微生物的黏附[18]。乳酸菌生物膜由蛋白質、多糖和磷酸鹽分子組成，其可以合成酸、細菌素及表面活性劑等拮抗化合物，因而得到國內外的高度重視[19-20]。 RANGASWAMY等人將德氏乳桿菌固定于網狀聚氨酷泡沫材料上后包裝在生物反應器中并用于乳酸發酵，乳酸生產的速率有了顯著的提高[21]。FURUKAWA等研究者發現釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜的形成促進于Fukumaya米醋發酵[22]。
本研究以新疆阿圖什及烏什傳統發酵酸奶中分離出57 株乳酸菌并采用96孔微量檢測法檢測其生物膜形成能力，接著以分子鑒定法鑒定可產生生物膜的乳酸菌，最后進行電子顯微鏡觀察生物膜結構圖。研究結果顯示，分離純化出的57 株菌中，16 株為強等黏附成膜菌，22 株為中等黏附成膜菌株。16 株強等黏附成膜乳酸菌中10 株為從烏什酸奶中分離到的，占總菌含量的17.54%，6 株為從阿圖什酸奶中分離到的，占總菌含量的10.52%。此實驗結果可進一步說明以烏什酸奶為來源的乳酸菌與阿圖什酸奶為來源的乳酸菌相比烏什酸奶為來源的乳酸菌顯出較高的生物膜形成能力，烏什酸奶拉絲性也強于阿圖什酸奶，實驗結果與原樣品特性一致。
本研究中可產生生物膜的乳酸菌歸屬于3 個屬6 種，其中15 株為耐久腸球、 3 株為屎腸球菌、 7 株為為Enterococcusthailandicus、2 株為Enterococcuslactis、6 株為植物乳桿菌、5 株為嗜熱鏈球菌。實驗結果表明8、9、18、22、23、25、26、28、29、34、35、37、L22、L30、M62、M63、70、71等18 株強黏附成膜菌株都屬于腸球菌；NG-107、118、120、129、131、132等6 株中等粘附成膜菌株屬于植物乳桿菌。此結果進一步說明腸球菌與植物乳桿菌相比具有較強的粘附成膜能力。丁武蓉等研究者實驗結果顯示乳桿菌屬產EPS產量為100～150 mg/L，腸球菌屬EPS產量為200～300 mg/L，227株乳酸菌中球菌產胞外多糖的能力高于桿菌[23]，與本研究結果一致。耐久腸球菌生物膜形成能力可能基于腸球菌屬EPS產量。
2個地區酸奶樣品中的乳酸菌菌群在種類、數量及生物膜形成能力方面具有顯著差異的可能性包括以下幾點：地區地理環境、酸奶制作環境、制作酸奶工藝過程中的習慣性細節(如接種、發酵溫度，使用的容器等)、牛奶濃度及質地和成分等。以上因素均能影響乳酸菌生物膜的形成能力。生物膜形成的原因及其機理待進一步深入研究。
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ScreeningandidentificationoflacticacidbacteriaformingbiofilmintraditionalfermentedmilkinSouthXinjiang
XIRINAY·Ablikim, MUYESSER·Yusup, NURGUL·Rahman*
(College of Life Sciences Xinjiang Normal University, Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology, Urumqi 830054， China)
To explore the Lactic acid bacteria diversity and biofilm formation in traditional fermented milk from Xinjiang longevity region, the samples were analyzed using pure culture and 16S rRNA gene sequence analysis, 96 well micro-plate semi -quantitative methods and scanning electron microscopy. Finally 57 strains were isolated from four samples. The micro-plate semi -quantitative method was used to investigate biofilm formation of strains. The results showed that 38 strains (73.68%) of the LAB showed biofilm formation ability, of which 16 strains (28.07%) strongly adhered to biofilm and 22strains (38.59%)were moderately adherent. The strains which can form biofilm were belonging to three species of six genera includingEnterococcusdurans(16 strains),Enterococcusffaecium(1 strains),Enterococcusthailandicus(7 strains),Enterococcuslactis(3 strains),Lactobacillusplantarum(6 strains),Streptococcusthermophilius(5strains),in whichEnterococcuswas the dominant species and was followed byLactobacillusandStreptococcus. These provided foundation for the development and utilization of LAB resources and their biofilm characteristics.
lactic acid bacteria；biofilm；ESM
10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013974
碩士研究生(努爾古麗·熱合曼副教授為通訊作者,E-mail:Nurgulum@163.com)。
國家自然科學基金(31460448)；國家自然科學基金(31160333)
2017-02-04，改回日期：2017-04-19
