面包酵母新型半連續(xù)發(fā)酵工藝研究

周小辛，劉鵬，李超，莊英萍，儲炬，黎亮，楊文靜，匡金寶

1(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200237) 2(湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，443003)

生產(chǎn)與科研經(jīng)驗(yàn)

面包酵母新型半連續(xù)發(fā)酵工藝研究

周小辛1，劉鵬1，李超1，莊英萍1，儲炬1，黎亮1，楊文靜2，匡金寶2

1(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，200237) 2(湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，443003)

對關(guān)乎面包酵母細(xì)胞貨架期的細(xì)胞內(nèi)的海藻糖積累條件和酵母菌體得率等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：發(fā)酵前期對菌體進(jìn)行碳源限制并不會引起海藻糖的提前積累，在發(fā)酵后期對菌體進(jìn)行溶氧限制可以提高菌體得率，同時(shí)不會引起海藻糖含量的降低。基于此研究結(jié)果提出了新型半連續(xù)發(fā)酵工藝，平均生產(chǎn)效率提高到3.7g/(L·h)，比原始工藝提高了60.8%。

面包酵母；菌體得率；海藻糖；半連續(xù)發(fā)酵

影響面包酵母性能的因素指標(biāo)主要有2點(diǎn)：菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖的含量。蛋白質(zhì)含量高則面包酵母的發(fā)酵活力高，海藻糖含量高則可以提高菌體的抗逆性及延長酵母的貨架期。海藻糖不僅作為一種貯藏性糖類，更作為應(yīng)激性代謝產(chǎn)物而廣泛存在于藻類、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲以及無脊椎動(dòng)物等生物體內(nèi)。海藻糖具有良好的抗逆保護(hù)作用，很多生物物種在脅迫環(huán)境下，比如高溫、冷凍、干燥、高滲透壓、有毒物質(zhì)、饑餓等環(huán)境，表現(xiàn)出的抗逆耐受力與體內(nèi)的海藻糖含量有密切的關(guān)系。同時(shí)，眾多研究報(bào)道顯示，酵母細(xì)胞在高溫，高壓，高滲，有毒等脅迫環(huán)境下有利于菌體內(nèi)快速大量積累海藻糖。在發(fā)酵培養(yǎng)基碳源充足的條件下，限制N、P源，此時(shí)菌體生長受到限制，海藻糖也會開始大量積累[1-4]。目前，工業(yè)生產(chǎn)過程中面臨著發(fā)酵后期酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖積累緩慢，菌體得率低的問題。本論文在現(xiàn)有的工廠發(fā)酵工藝基礎(chǔ)之上，利用對發(fā)酵過程生理代謝特征參數(shù)開展多參數(shù)相關(guān)性分析找到了影響海藻糖積累的相關(guān)因素，利用在線采集生理參數(shù)二氧化碳釋放率(carbon dioxide evolution rate, CER)和氧消耗速率(oxygen uptake rate, OUR)反饋進(jìn)行補(bǔ)料，最終實(shí)現(xiàn)了在50 L生物反應(yīng)器水平上的活性酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖快速積累和菌體得率的提高，為接下來中試放大生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本論文也結(jié)合這些影響因素提出了兩階段半連續(xù)發(fā)酵這一新工藝，以期進(jìn)一步提升發(fā)酵效率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株

面包酵母菌株由湖北安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，YE20，MgSO41，KH2PO41，瓊脂20。

搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，YE20，MgSO41，KH2PO41。

種子培養(yǎng)基(g/L)：原糖蜜5.6，MgSO42.7，ZnSO41。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：原糖蜜6.7，MgSO42.7，ZnSO41。

補(bǔ)料培養(yǎng)基1(g/L)：原糖蜜405。

補(bǔ)料培養(yǎng)基2(g/L)：NH4H2PO448。

補(bǔ)料培養(yǎng)基3(g/L)：(NH4)2SO419.5。

補(bǔ)料培養(yǎng)基4(%)：氨水25。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)皿于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后刮下菌苔接種于裝液量為1 L的2 L搖瓶中，將搖瓶置于30 ℃搖床間，180 r/min，培養(yǎng)20 h。然后接種于50 L種子罐，通過流加0.5 mol/L的Na2CO3溶液控制培養(yǎng)過程的pH在4.8～5.2之間，流加補(bǔ)料培養(yǎng)基1、2、3，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和通氣流量使溶氧不低于30 %，培養(yǎng)溫度維持在30 ℃，待菌體濃度達(dá)到160 g/L。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

本研究采用的50 L生物反應(yīng)器(上海國強(qiáng)生化裝備有限公司)為攪拌式，初始裝液量為18 L，將上述培養(yǎng)好的種子移接至50L發(fā)酵罐，接種量為15 %，溫度34 ℃，從發(fā)酵0 h開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基1、2、4，通過流加0.5 mol/L的Na2CO3溶液控制發(fā)酵過程pH在4.8～5.2之間。

1.3分析方法

菌體濃度(g/L)測定：準(zhǔn)確稱取空離心管質(zhì)量(m1)，準(zhǔn)確量取10 mL發(fā)酵液置于離心管中，4 000 r/min,離心10 min,棄上清液，稱重(m2)，菌體濃度計(jì)算公式：

(1)

酵母干物質(zhì)百分含量測定：稱取1.5 g(精確至0.000 1 g)搗碎的鮮酵母，于已烘至恒重的稱量瓶中，放入電熱干燥箱，溫度控制在103±2 ℃，烘3 h，移入干燥器中冷卻至室溫，稱重。再放入電熱干燥箱內(nèi)，繼續(xù)烘干，直至恒重，稱重，計(jì)算公式：

(2)

式中：X，干物質(zhì)的百分含量，%；m，稱量瓶的恒重質(zhì)量，g；m1，烘干前稱量瓶加樣品的恒重質(zhì)量，g；m2，烘干后稱量瓶加樣品的恒重質(zhì)量，g。

乙醇含量的測定：在硫酸存在條件下，重鉻酸鉀將乙醇定量地氧化成醋酸，過量的重鉻酸鉀與碘化鉀反應(yīng)生成碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。試樣中乙醇含量按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：X, 試樣中乙醇的百分含量，%；c, 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；v1, 試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；v2, 吸取試樣的體積，mL；n,稀釋倍數(shù)；0.014 6, 1.00mL硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.000 mol/L)相當(dāng)于乙醇的量。

海藻糖含量測定：采用蒽酮法測定[5]。

蛋白質(zhì)含量測定：采用凱氏定氮法測定[6]。

發(fā)酵液中總糖的測定：采用DNS法測定[7]。

1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 對照組實(shí)驗(yàn)

整個(gè)發(fā)酵過程通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量使溶氧保持在30%以上。接種后開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基1、2、4，pH控制在4.8～5.2之間，發(fā)酵第10 h停止流加補(bǔ)料培養(yǎng)基2和4。發(fā)酵培養(yǎng)過程中每隔1 h取樣檢測發(fā)酵液中乙醇含量，整個(gè)發(fā)酵過程的乙醇含量控制在0.15%以內(nèi)，根據(jù)乙醇百分含量來調(diào)整補(bǔ)料培養(yǎng)基1的補(bǔ)料速率。

1.4.2 影響面包酵母活性的關(guān)鍵因素考察

面團(tuán)醒發(fā)過程要求面包酵母細(xì)胞具有較高的發(fā)酵活力，面包酵母的發(fā)酵活力與酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白含量有著密切的聯(lián)系，細(xì)胞內(nèi)蛋白含量高則酵母細(xì)胞能夠快速利用面團(tuán)中淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖供細(xì)胞生長代謝，同時(shí)產(chǎn)CO2氣體使面團(tuán)蓬松，即發(fā)酵活力高。酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量越高，酵母的耐貯存力越強(qiáng)，提高酵母細(xì)胞中海藻糖含量是提高鮮酵母耐貯存力增強(qiáng)其抗逆性的重要途徑[8-9]。因此，如何采取有效措施提高酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量，探索影響海藻糖積累的因素成為本研究的重要內(nèi)容之一。

實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵前10 h限制補(bǔ)料培養(yǎng)基1的流加速率，通過溶氧電極(梅特勒-托利多，瑞士)在線監(jiān)測溶氧，控制溶氧在20%～30%，其他發(fā)酵培養(yǎng)條件與對照組保持一致。發(fā)酵10 h之后補(bǔ)料培養(yǎng)基1的流加工藝控制和對照組一致。每隔1 h取樣測定菌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量和海藻糖含量以及發(fā)酵液中殘磷濃度。

1.4.3 影響面包酵母得率的關(guān)鍵因素考察

分析糖的消耗途徑(圖1)可以看出，流加進(jìn)入發(fā)酵罐的糖蜜主要用于同化生成菌體、異化產(chǎn)能生成CO2，在氧限制條件下還會生成副產(chǎn)物乙醇。其中異化作用產(chǎn)能用于以下3個(gè)方面，1是用于菌體生長；2是用于海藻糖積累(海藻糖積累的過程需要消耗能量，1 mol蔗糖轉(zhuǎn)化成1 mol海藻糖需要消耗3 mol ATP)；3是用于菌體維持。提高菌體得率的唯一途徑是降低副產(chǎn)物乙醇積累和減少菌體維持能。

圖1 糖的代謝消耗方式Fig.1 The metabolic pathway of sucrose

實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵前10 h培養(yǎng)工藝條件和對照組工藝條件保持一致，10 h之后結(jié)合OUR和發(fā)酵過程測定產(chǎn)生乙醇的含量開始調(diào)整供氧(降低轉(zhuǎn)速和通氣量)，通過降低攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量使實(shí)驗(yàn)組OUR和CER在現(xiàn)有基礎(chǔ)之上降低20 %以上，調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基1的補(bǔ)入速率，控制乙醇含量低于0.15 %，維持5 h的低供氧條件。觀察發(fā)酵過程OUR和CER變化，同時(shí)每隔1 h取樣測定菌體內(nèi)海藻糖和蛋白含量的變化。

1.4.4 兩階段半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)流程示意圖如下(圖2)，實(shí)驗(yàn)采用2個(gè)50 L發(fā)酵罐(A、B)，發(fā)酵罐B空消滅菌處理待用，發(fā)酵罐A接種后將攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量調(diào)至最大以保持整個(gè)發(fā)酵過程高供氧狀態(tài)，在維持發(fā)酵過程產(chǎn)生的乙醇含量低于0.15%條件下提高糖蜜流加速率，至第10 h停止流加補(bǔ)料培養(yǎng)基2和4，再將A罐發(fā)酵液轉(zhuǎn)移18 L至B罐。

圖2 兩階段半連續(xù)發(fā)酵工藝流程示意圖Fig.2 Semi-continuous fermentation process schematic diagram

轉(zhuǎn)移完全之后，B罐開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基1，并通過流加0.5 mol/L的Na2CO3溶液來控制發(fā)酵pH維持在4.8～5.2，調(diào)節(jié)B罐攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量使B罐的CER和OUR在A罐發(fā)酵第10 h的CER和OUR水平基礎(chǔ)之上降低20%以上，控制過程中乙醇產(chǎn)生量在0.15%以內(nèi)，通過發(fā)酵過程測定乙醇產(chǎn)生量來反饋調(diào)節(jié)糖蜜流加速率，維持5 h。

同時(shí)，向A罐添加滅菌處理過的MgSO4和ZnSO4無機(jī)鹽溶液將A罐剩余發(fā)酵液菌濃稀釋至A罐發(fā)酵第4 h水平，并同時(shí)開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基1、2、4，其他發(fā)酵培養(yǎng)條件同A罐發(fā)酵周期4～10 h的培養(yǎng)條件一致，依此循環(huán)3個(gè)周期。

2 結(jié)果與討論

2.1影響面包酵母活性的關(guān)鍵因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

比較實(shí)驗(yàn)組和對照組發(fā)酵過程中發(fā)酵液殘磷濃度變化(圖3)，兩者濃度變化走勢一致，發(fā)酵前期磷源補(bǔ)入速率大于菌體利用速率導(dǎo)致殘磷濃度緩慢上升；中期菌體快速生長利用磷源，此時(shí)殘磷濃度開始下降；發(fā)酵第10 h停止供應(yīng)磷源后發(fā)酵液中殘磷濃度迅速降低到0.3 mmol/L以下。實(shí)驗(yàn)組菌體內(nèi)海藻糖含量變化相對于對照組并沒有出現(xiàn)提前開始大量累積的現(xiàn)象，兩組實(shí)驗(yàn)菌體的海藻糖含量均是在發(fā)酵周期10 h之后開始從1.0 %左右迅速大幅度累積到11.0 %左右。造成這一現(xiàn)象的原因是10 h之后磷源的限制引起菌體生長變緩，從而引起海藻糖的積累，實(shí)驗(yàn)組前10 h進(jìn)行碳源的限制并非是引起海藻糖積累的主要因素。

圖3 菌體內(nèi)海藻糖含量和發(fā)酵液中殘磷含量變化曲線圖Fig.3 Variation curves of the intracellular trehalose content and residual phosphorus content in fermentation broth

將2組實(shí)驗(yàn)菌體內(nèi)蛋白含量變化進(jìn)行比較(圖4)，發(fā)現(xiàn)2組實(shí)驗(yàn)菌體內(nèi)蛋白相對百分含量在發(fā)酵周期前10 h一直維持在53 %左右，10 h之后蛋白的相對百分含量開始下降，造成這一現(xiàn)象的原因是發(fā)酵第10 h之后菌體內(nèi)海藻糖開始大量累積引起菌體蛋白的相對比例下降。除去累積的海藻糖，面包酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白的絕對含量下降的并不明顯。

圖4 菌體內(nèi)蛋白含量變化曲線圖Fig.4 Variation curves of the intracellular protein content

菌體內(nèi)蛋白和海藻糖的含量處于相對變化狀態(tài)，海藻糖的大量累積會造成蛋白的相對含量降低。因此，在企業(yè)生產(chǎn)上要控制面包酵母胞內(nèi)海藻糖的含量，雖然海藻糖含量越高菌體的抗逆性越好，但是也會造成面包酵母胞內(nèi)蛋白相對含量大幅降低導(dǎo)致其發(fā)酵活力水平的下降，控制發(fā)酵過程面包酵母活性的關(guān)鍵因素在于海藻糖積累的控制。

2.2影響面包酵母得率的關(guān)鍵因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

發(fā)酵周期第10 h開始溶氧限制之后，CER、OUR迅速降低(圖5)，降低幅度在25 %以上。發(fā)酵過程后期溶氧限制后，海藻糖積累速率仍然較快，相比對照組海藻糖積累變化，實(shí)驗(yàn)組海藻糖的累積并沒有出現(xiàn)延滯，發(fā)酵結(jié)束最終測得胞內(nèi)海藻糖含量為13.76%，對照組最終胞內(nèi)海藻糖含量為10.61%。整個(gè)過程測得乙醇含量均低于0.05%，實(shí)驗(yàn)組后期溶氧限制引起酵母細(xì)胞呼吸代謝速率降低，CO2產(chǎn)生速率減小，CER和OUR降低，根據(jù)發(fā)酵過程碳元素的平衡，流加進(jìn)發(fā)酵罐中的碳源大部分流向菌體生長和積累海藻糖，從而提高了碳源的利用率，使菌體得率提高。

圖5 OUR、CER和海藻糖變化曲線圖Fig.5 Variation curves of OUR,CER and trehalose

分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對照組最終菌體平均絕對得率(圖6)，對照組最終菌體平均絕對得率為0.45，比實(shí)驗(yàn)組最終菌體平均絕對得率低0.12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明發(fā)酵后期在糖充足的情況下進(jìn)行溶氧限制可以顯著降低維持能，提高菌體得率，同時(shí)對溶氧進(jìn)行限制造成菌體生長的不利環(huán)境，有利于胞內(nèi)海藻糖的積累。

圖6 菌體平均絕對得率Fig.6 The histogram of average yield

2.3兩階段半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與討論

兩階段半連續(xù)發(fā)酵工藝過程中，A罐菌體蛋白和海藻糖含量(圖7)測定顯示，經(jīng)過3次循環(huán)后，菌體胞內(nèi)的海藻糖和蛋白含量與對照組批次發(fā)酵過程前10 h菌體的海藻糖和蛋白含量基本相同，蛋白含量均維持在53 %左右，而海藻糖含量維持在1 %左右，結(jié)果說明經(jīng)過多次循環(huán)后A罐內(nèi)菌體基本生理狀態(tài)沒有發(fā)生顯著變化。

圖7 菌體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖變化曲線圖Fig.7 Variation curves of protein and trehalose in the cell

圖8和圖9為兩階段半連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)B罐三次循環(huán)過程中菌體內(nèi)海藻糖和蛋白含量變化曲線(其中B1、B2和B3分別代表B罐第1次、第2次和第3次循環(huán))，各批次發(fā)酵液從A罐轉(zhuǎn)移至B罐之后，菌體胞內(nèi)開始迅速大量累積海藻糖，最終海藻糖含量均在14%左右，而對照組最終胞內(nèi)海藻糖含量為10.61%，這是由于B罐攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量小，造成菌體生長環(huán)境溶氧脅迫，菌體利用碳源開始大量合成海藻糖。同時(shí)，B罐中菌體的呼吸作用減弱，維持能降低，提高了碳源的利用率。

圖8 菌體內(nèi)海藻糖變化曲線圖Fig.8 Variation curves of trehalose in the cell

圖9 菌體內(nèi)蛋白相對含量變化曲線圖Fig.9 Variation curves of protein in the cell

各循環(huán)批次最終所得菌體細(xì)胞的蛋白相對百分含量和海藻糖含量分別在44%和14%左右，兩者均滿足企業(yè)生產(chǎn)質(zhì)檢要求。兩階段半連續(xù)發(fā)酵工藝前一階段創(chuàng)造菌體生長有利環(huán)境，促進(jìn)酵母細(xì)胞快速生長繁殖；后一階段進(jìn)行溶氧限制創(chuàng)造脅迫環(huán)境有利于海藻糖的積累。

表1對比分析了兩階段半連續(xù)發(fā)酵與常規(guī)批發(fā)酵生產(chǎn)效率和得率等數(shù)據(jù)，從表中數(shù)據(jù)可以看出，在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，半連續(xù)發(fā)酵方式比傳統(tǒng)發(fā)酵方式的平均單罐生產(chǎn)效率提高了60.8 %。

表1 原有工藝和半連續(xù)工藝比較

半連續(xù)培養(yǎng)和分批補(bǔ)料培養(yǎng)相比較，半連續(xù)培養(yǎng)省去放料，發(fā)酵罐的清洗、滅菌和冷卻等步驟，避免了延遲期，因而相關(guān)的設(shè)備利用率高，菌體的生產(chǎn)效率相應(yīng)得到提高。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)整個(gè)發(fā)酵過程補(bǔ)糖速率和菌體呼吸代謝的控制是提高菌體得率的關(guān)鍵。發(fā)酵前期控制合適的補(bǔ)糖速率，在控制乙醇產(chǎn)生含量低于0.15 %的情況下維持菌體較高比生長速率有利于菌體快速繁殖生長；發(fā)酵后期菌體生長受到N、P等限制，菌體生長變緩慢，發(fā)酵后期補(bǔ)入大量的糖，一部分糖轉(zhuǎn)化成海藻糖形式儲存在胞內(nèi)，另外部分糖用于菌體呼吸，因此發(fā)酵后期可適當(dāng)限制供氧，減少菌體呼吸作用消耗的糖，從而提高菌體得率。

綜合以上結(jié)果可以看出，兩階段半連續(xù)發(fā)酵工藝具有生產(chǎn)效率高、菌體得率較高的優(yōu)勢。同時(shí)，在半連續(xù)發(fā)酵工藝的后一階段進(jìn)行溶氧限制提供了脅迫環(huán)境，有利于酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的積累。因此，兩階段半連續(xù)發(fā)酵工藝具有可行性和優(yōu)勢性。

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Studyonnewsemi-continuousfermentationprocessofbaker'syeast

ZHOU Xiao-xin1, LIU Peng1, LI Chao1, ZHUANG Ying-ping1*, CHU Ju1 , LI Liang1, YANG Wen-jing2, KUANG Jin-bao2

1(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) 2(Angel Yeast Co.,Ltd, Yichang 443003, China)

In this paper, the trehalose accumulation conditions and cell yield of baker's yeast were studied. The results showed that the limitation of carbon source in the early stage of fermentation did not cause the accumulation of trehalose in advance. Dissolved oxygen limit in the later stage of fermentation could increase the cell yield without reducing the trehalose content. Based on the results of this study, a novel semi - continuous fermentation process was proposed. The average production efficiency was increased to 3.7 g/(L·h), which was 62.7% higher than that of the original process, which provided a new idea for efficient production of highly active yeast.

baker's yeast; cell yield; trehalose; semi-continuous fermentation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014012

碩士研究生(莊英萍為通訊作者， E-mail:ypzhuang@ecust.edu.cn)。

2017-02-09，改回日期：2017-03-14