三元離子締合物測定牛奶中的四環(huán)素殘留

單展，范晶晶，馬小龍，唐寧莉

1(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林， 541004) 2(桂林理工大學 廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，廣西 桂林,541004)

分析與檢測

三元離子締合物測定牛奶中的四環(huán)素殘留

單展1，范晶晶1，馬小龍1，唐寧莉*

1(桂林理工大學 化學與生物工程學院，廣西 桂林， 541004) 2(桂林理工大學 廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，廣西 桂林,541004)

在醋酸溶液中，四環(huán)素(tetracycline，Tc)與Cu2+形成螯合陽離子，然后進一步與帶負電荷的鉻天青S通過靜電引力形成三元離子締合物，導致反應(yīng)體系的共振散射信號增強，據(jù)此建立了一種測定痕量Tc的共振散射光譜新方法。在最佳條件下，波長700 nm處，Tc濃度與體系共振散射強度的增加值(ΔI)在0.2～22 μmol/L呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：ΔI=1.021×107c+1.437(c為Tc的濃度，mol/L)，方法的檢出限為8.81×10-9mol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。將該方法應(yīng)用于牛奶樣品中Tc的測定，回收率為100.00%～101.20%。

鉻天青S；四環(huán)素；牛奶；共振散射

四環(huán)素(tetracycline，Tc)是一種具有廣譜抗菌活性的抗生素，可作為預(yù)防和治療禽畜疾病的獸藥或作為飼料添加劑應(yīng)用于動物飼料中。近年來，隨著我國禽畜養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，殘留的四環(huán)素對環(huán)境和人類健康構(gòu)成了巨大的潛在危險和威脅。因此四環(huán)素的痕量分析對于環(huán)境監(jiān)管和食品監(jiān)管部門是非常重要的工作。目前，測定Tc的主要方法有高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)[1-2]、毛細管電泳、酶聯(lián)免疫分析法[3]、紫外-可見分光光度法[4-5]、熒光光度法[6-7]、共振散射法[8-9]等。

共振散射光譜法(resonance light scattering，RLS)具備簡易、靈敏、快速和成本低的優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于檢測痕量金屬離子、生物大分子和藥物。但目前應(yīng)用共振散射光譜技術(shù)定量檢測四環(huán)素的研究較少。本研究利用四環(huán)素分子中C11、C12位上的β-二酮結(jié)構(gòu)與金屬離子Cu2+形成二元陽離子，然后二元陽離子進一步與帶負電荷的鉻天青S通過靜電引力形成三元離子締合物，導致反應(yīng)前后體系的共振散射強度發(fā)生變化，從而建立測定四環(huán)素的共振散射光譜新方法，進一步提高了方法的靈敏度和選擇性，并用實驗驗證了反應(yīng)機理。

1 實驗部分

1.1儀器與試劑

Cary Eclipse型熒光光度計，美國Varian；ZS90型納米粒度與Zeta電位分析儀,英國Malvern公司；pHS-3C型精密pH計,上海雷磁儀器廠。

四環(huán)素標準溶液(Tc，90%，美國Amresco公司)：1.0×10-3mol/L的Tc儲備液，Tc工作液(1.0×10-4mol/L)由儲備液稀釋得到；Cu2+溶液(1.0×10-2mol/L)，由CuSO4(廣州化學試劑廠)配制；鉻天青S溶液(CAS，1.2×10-3mol/L),上海試劑三廠;HCl、H2SO4、HAc溶液(5.0×10-5mol/L),廣東汕頭市西隴化工股份有限公司。

實驗用水均為二次去離子水，所用試劑均為分析純。盒裝鮮牛奶樣品，購于當?shù)爻小?/p>

1.2實驗方法

在10 mL的比色管中，分別加入5.0×10-5mol/L的HAc溶液0.5 mL，1.0×10-2mol/L的Cu2+溶液1.0 mL，1.2×10-3mol/L的CAS溶液1.0 mL和一定量的Tc工作液(以不加Tc的溶液為試劑空白)，加水稀釋至10 mL，搖勻，25 ℃反應(yīng)10 min后，在熒光光度計上以λex=λem方式進行同步掃描，記錄波長700 nm處加有四環(huán)素標準溶液的RLS強度I和試劑空白的RLS強度I0，并計算RLS強度差值ΔI=I-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1體系的共振散射光譜

按照實驗方法掃描了體系不同組合的RLS光譜，結(jié)果如圖1所示。在HAc溶液中，Cu2+、CAS、Tc的兩兩反應(yīng)產(chǎn)物(圖1中的a～c)的RLS強度均較弱，但當三者共存時，體系的RLS強度隨Tc的加入量增大而增強(圖1中的d和e)，同時在700 nm處具有最強的RLS峰，由此可見三者結(jié)合生成三元離子締合物導致體系的RLS強度增強。

a:四環(huán)素與銅離子混合溶液；b:四環(huán)素與鉻天青S混合溶液；c:鉻天青S與銅離子混合溶液；d-e:鉻天青S與銅離子及四環(huán)素混合溶液四環(huán)素的濃度: 1.0×10-5 mol/L(a,b,e); 5.0×10-6 mol/L (d)圖1 體系的共振散射光譜Fig.1 Resonance light scattering spectra of the systems

2.2實驗條件的選擇

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)的選擇

按實驗方法分別考察了HCl、H2SO4、HAc三種溶液不同濃度下體系的ΔI值，結(jié)果表明,在HAc溶液中體系的ΔI值較大且重現(xiàn)性好，說明體系在弱酸介質(zhì)中比較穩(wěn)定。實驗發(fā)現(xiàn)，體系在0.5 mL的5.0×10-5mol/L的HAc溶液中ΔI值最大，靈敏度最高，故選擇5.0×10-5mol/L的HAc溶液作為最佳反應(yīng)介質(zhì)，用量為0.5 mL。

2.2.2 CuSO4用量的選擇

在0.2～1.0 mL內(nèi)，隨著CuSO4用量的增加，Cu2+開始與Tc結(jié)合形成螯合物，體系的ΔI值不斷增大。當CuSO4的用量為1.0 mL時，體系的ΔI值達到最大；當CuSO4的用量超過1.0 mL后，體系的ΔI值逐漸下降，故選擇1.0×10-2mol/L CuSO4的用量為1.0 mL。

2.2.3 鉻天青S用量的選擇

當鉻天青S的用量為1.0 mL時，體系的ΔI值達到最大；鉻天青S的用量過多或過少都會使體系的ΔI值下降，故選擇1.2×10-3mol/L鉻天青S的用量為1.0 mL。

2.2.4 反應(yīng)時間的選擇

在室溫條件下，體系反應(yīng)5 min即可反應(yīng)完全，在3 h內(nèi)體系的ΔI值基本保持穩(wěn)定。為了便于實驗操作，實驗選擇在反應(yīng)10 min后進行測定。

2.2.5 反應(yīng)溫度的選擇

在10～25 ℃內(nèi)，隨著溫度升高，體系ΔI值逐漸增大；當溫度達到25 ℃時，體系ΔI值最大；25 ℃后隨著溫度繼續(xù)上升，體系ΔI值下降。原因可能是溫度過高，破壞了體系之間的靜電引力作用，從而導致體系的RLS強度減弱，ΔI值下降。故選擇25 ℃作為反應(yīng)溫度。

2.2.6 試劑加入順序的選擇

當試劑加入順序為Tc-Cu2+-HAc-CAS時，體系的ΔI值較其他加入順序的ΔI值大，故選擇最佳的試劑加入順序為：Tc-Cu2+-HAc-CAS。

2.3工作曲線和方法的檢出限

在最優(yōu)的實驗條件下，按照實驗方法檢測λ=700 nm處不同濃度四環(huán)素標準的RLS強度，Tc濃度在0.2～22 μmol/L內(nèi)與ΔI呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔI=1.021×107c+1.437，c為Tc的濃度，單位為mol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。按實驗方法平行測定空白13次，標準偏差S=0.03，根據(jù)DL=3S/K(K為回歸方程的斜率)，求得檢出限為8.81×10-9mol/L。

2.4干擾物質(zhì)的影響

當Tc濃度為4.3 μg/mL時，考查了可能存在的干擾物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，當相對誤差≤±5%時，共存物質(zhì)的允許量為(μg/mL)：蔗糖(860)；K+(430)；Ca2+(340)；Na+(300)；NH4+(250)；葡萄糖、淀粉和L-精氨酸(210)；Mg2+、NO3-、SO42-和L-天冬氨酸(130)；L-酪氨酸(90)；DL-半胱氨酸和甘氨酸(60)。Fe2+(2.6)、Fe3+(3.4)、Al3+(5.1)干擾比較大，可加入EDTA進行掩蔽。

2.5樣品測定

在當?shù)爻匈徺I蒙牛、伊利純牛奶作為樣品。準確量取5.0 mL牛奶樣品置于100 mL離心管中，加入50 mL乙酸鹽緩沖液-乙腈混合溶液(體積比1∶4)，振蕩搖勻5 min，5 000 r/min離心20 min除去蛋白質(zhì)。取上清液至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振蕩搖勻5 min，靜置分層后棄去正己烷層。吸取下層清液，用正已烷反復(fù)脫脂至澄清，待用[10]。取一定體積的樣品待測液，按照實驗方法測定其共振散射強度，未檢出四環(huán)素。為考察實驗方法的可行性，進行加標回收實驗(表1)。由表中可以看出本方法的加標回收率為100.00%～101.20%，結(jié)果令人滿意。

3 反應(yīng)機理探討

3.1表面活性劑的影響

在體系中分別加入了陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、 陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(DBS) 和非離子表面活性劑阿拉伯膠(AG)，觀察體系RLS強度的變化情況。實驗結(jié)果表明，當體系中加入CTMAB后，空白體系的RLS強度I0值隨CTMAB的加入量增加而增大，同時加入Tc標準溶液的反應(yīng)體系的RLS強度I值也隨CTMAB的加入量增加而增大，且CTMAB加入量相同條件下I值要比I0值大，說明帶正電荷的CTMAB、Tc與Cu2+形成的二元陽離子同時與帶負電荷的CAS發(fā)生靜電引力作用，導致體系的I0、I值均增大。當體系中加入DBS后，空白體系I0隨DBS的加入量增加基本不變，表明帶負電荷的DBS與帶負電荷的CAS不發(fā)生反應(yīng)；而當體系中加入一定量Tc標準溶液后，I值隨DBS的加入量增加而增大，且I值大于I0值，說明帶負電荷的DBS、CAS同時與帶正電荷的Tc與Cu2+形成的二元陽離子作用從而使反應(yīng)體系I值增大。當體系中加入AG后，空白體系的I0和加入Tc標準溶液的反應(yīng)體系的I值均隨AG的加入量增加基本不變，說明AG與帶負電的CAS和帶正電的Tc與Cu2+形成的二元陽離子幾乎都不反應(yīng)。

表1 樣品和回收率分析結(jié)果(n=5)

綜上所述，可得出CAS同Tc與Cu2+形成的二元陽離子之間是通過靜電引力結(jié)合形成離子締合物的。

3.2粒徑分析

a:鉻天青S溶液；b:四環(huán)素與銅離子混合溶液；c:鉻天青S與銅離子混合溶液;d-e:鉻天青S與銅離子及四環(huán)素混合溶液四環(huán)素的濃度: 1.0×10-5mol/L(b,d); 1.5×10-5mol/L(e)圖2 反應(yīng)體系的粒徑分析Fig.2 Particle size analysis of the reaction system

圖2是反應(yīng)物和產(chǎn)物的粒徑分析圖，由圖2可知，CAS、CAS與Cu2+、Tc與Cu2+的平均粒徑比較小，分別為134 nm、211 nm和247 nm(圖2中的a、b和c)，當三者結(jié)合反應(yīng)生成三元離子締合物后，形成的產(chǎn)物的平均粒徑明顯增大，加入1.0×10-5mol/L Tc后，平均粒徑約為619 nm(圖2中的d)，加入1.5×10-5mol/L Tc后，平均粒徑約為1 012 nm(圖2中的e)，由此可見，三者結(jié)合反應(yīng)后生成更大粒徑的締合微粒，這與RLS光譜結(jié)果相符合。

4 結(jié)論

本文研究了Tc-Cu2+-CAS三元離子締合物反應(yīng)的RLS光譜，發(fā)現(xiàn)三者結(jié)合導致體系RLS信號顯著增強，且RLS強度增加值與Tc的濃度在0.2～22 μmol/L內(nèi)成正比，據(jù)此建立了定量測定四環(huán)素的RLS新方法。該方法靈敏度高、選擇性好，操作簡便、快速，可應(yīng)用于牛奶中Tc含量的測定。

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Determinationoftetracyclineresiduesinmilkusingternaryion-associationcomplexes

SHAN Zhan1,FAN Jing-jing1,MA Xiao-long1,TANG Ning-li*

1(College of Chemistry and Biological Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China) 2(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection, Guilin University of Technology，Guilin 541004,China)

In HAc solution, tetracycline(Tc) reacted with Cu2+to form cation chelates, which further reacted with chromeazurol S to form a ternary ion-association complexes. This enhanced resonance scattering signals. A new resonance light scattering method was established for the determination of trace Tc. Under the optimal conditions, the increase of the intensity(ΔI) at 700nm was linear to concentration of Tc in the range of 0.2-22 μmol/L. Its regression equation was ΔI=1.021×107c+1.437, with a correlation coefficient of 0.999 0 and a detection limit of 8.81×10-9mol/L. This method was applied in determination of Tc in milk samples with satisfactory results. The recovery was within the range of 100.00%-101.20%.

chromeazurol S; tetracycline;milk;resonance light scattering

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013486

碩士研究生(唐寧莉教授為通訊作者，E-mail: ysshiyanshi@163.com)。

2016-11-25，改回日期：2017-01-03