2，4—二叔丁基苯酚為內標高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度

萬海方+黃焱明+汪國香+羅宏+張相彩+陶凡+趙萃+王振

[摘要] 目的 建立以2，4-二叔丁基苯酚為內標的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度方法。 方法 血清樣品用乙腈-甲醇（75：25）混合液蛋白沉淀后取上清液進樣分析，以2，4-二叔丁基苯酚為內標，采用UltimateRXB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水（H3PO4調pH=1.8）-乙腈（70∶30）為流動相，流速1.5 mL/min，檢測激發波長270 nm。結果 該法專屬性高，回收率高，日內日間RSD低。丙泊酚血藥濃度在0.2～10.0 mg/L范圍內線性關系良好（r2=0.9998），最低檢測濃度0.2970 mg/L。 結論 本方法測定丙泊酚濃度方便、快捷、準確度好、精密度高，為開展血藥濃度檢測、藥動學研究提供方法學依據。

[關鍵詞] 丙泊酚；高效液相色譜法；血藥濃度；2，4-二叔丁基苯酚

[中圖分類號] R614 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）20-0105-04

[Abstract] Objective To establish a detecting method of propofol plasma concentration by HPLC with 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard. Methods The supernatant of serum samples were analyzed after protein precipitation by acetonitrile-methyl alcohol（75∶25） mixed liquor. With 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard， UltimateR XB-C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Water（H3PO4， pH=1.8）-acetonitrile（70∶30） was used as mobile phase， flow velocity=1.5 mL/min， and detecting excitation wave length=270 nm. Results This method had high specificity and recovery， with low intra-day and inter-day RSD. When the plasma concentration of propofol was between 0.2～10.0 mg/L， it showed a good linear relation（r2=0.9998）， and the lower limit of detection was 0.2970 mg/L. Conclusion This method is convenient and speedy， with high accuracy and precision， providing a methodological basis for plasma concentration detection and pharmacokinetic research.

[Key words] Propofol； HPLC； Plasma concentration； 2， 4-ditert-butyl phenol

丙泊酚（propofol），2，6-二異丙基苯酚，又名異丙酚，是速效短效靜脈麻醉藥。近年來，國內外有關丙泊酚藥物代謝動力學的研究較多[1-4]，但未見丙泊酚應用于結核性膿胸患者的藥動學研究。為開展該研究，為臨床麻醉合理使用丙泊酚提供依據，本文建立了以2，4-二叔丁基苯酚為內標的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度。現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國，Agilent），配有G1311A四元泵、G1315D紫外檢測器、G1329A型進樣器（配有20 μL 進樣環）、G1316A柱溫箱和Agilent化學工作站；XS205 Dual Range分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；Mettler Toledo Delta 320 pH計（瑞士，Mettler Toledo）；高速離心機（美國，Thermo Fisher）；Barnstead TII超純水系統（美國，Thermo Fisher）；-80℃冰箱（日本，SANYO）。

1.2 藥品與試劑

丙泊酚注射液（規格：200 mg/支，批號：AJ059）、丙泊酚對照品（日本東京化成工業株式會社生產，規格：25 g，批號：ZR28L-FK，純度>98.0%）；內標：2，4-二叔丁基苯酚（北京百靈威科技有限公司生產，規格：100 g，批號：LI200111，純度≥99.5%）；色譜級乙腈和甲醇從美國天地公司購得，本文中其他所有分析級化學品均由天津永大化學試劑有限公司購得；實驗用超純水均由美國賽默飛世爾Barnstead TII 超純水系統純化制得。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：UltimateRXB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭材料科技有限公司），流動相：水（H3PO4調pH=1.8）-乙腈（70∶30）；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 稀釋液 乙腈-甲醇（75：25）。

2.2.2 丙泊酚對照品溶液 精密稱取40.00 mg丙泊酚對照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度；精密移取上述溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.2.3 2，4-二叔丁基苯酚儲備液 精密稱取10.00 mg 2，4-二叔丁基苯酚對照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度。

2.2.4 2，4-二叔丁基苯酚對照品溶液 精密移取2，4-二叔丁基苯酚儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.3 血樣處理

取出存放在-80 ℃冰箱中血樣，室溫解凍后取血樣400 μL，加入10 μL 內標2，4-二叔丁基苯酚儲備液，590 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進樣。

2.4 方法專屬性實驗

取空白血樣400 μL，加入600 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進樣，得空白血清色譜圖1A，將一定濃度的丙泊酚標準品及內標加入空白血清，按2.3項操作得色譜圖1B，受試者注射丙泊酚后，同法操作，得色譜圖1C，可見丙泊酚與內標2，4-二叔丁基苯酚的保留時間分別為6.65 min和10.67 min，兩者峰形良好，分離完全，理論塔板數按丙泊酚計算不低于14 837。

3 結果

3.1 標準曲線

取丙泊酚對照品，配制成濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。以丙泊酚的濃度（X）為橫坐標，丙泊酚的峰面積（Y）為縱坐標，得到標準曲線回歸方程為：Y=3.2733X-0.1223（r2=0.9998）。定量下限為0.2 mg/L。見圖2。

3.2 回收率試驗

取空白血清加入丙泊酚對照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質量控制血清樣品，各5份，按照2.3項下方法操作，進樣測定，計算回收率，結果見表1。

3.3 精密度試驗

取空白血清，加入丙泊酚對照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質量控制血清樣品，各5份，按照2.3項下方法操作，1 d內重復測定5次，以測定日內RSD。另取上述不同濃度的血清樣品，同樣處理，每日測定1次，重復測定5 d，以測定日間RSD，結果見表1。

3.4 臨床樣品準備

胸外科結核性膿胸住院手術患者10例，年齡27～63歲，體重47～63.5 kg，1%丙泊酚按2 mg/kg的劑量單次靜脈給予，20 s注射完畢，分別于給藥結束后2、4、6、8、10、15、20、30、60、90 min通過橈動脈測壓管采動脈血1.5 mL，分離血清，存放在-80℃冰箱中，測定丙泊酚血藥濃度。結果見圖3。

4討論

結核病嚴重影響人民健康，是我國重點防治疾病之一[5]。對結核性膿胸及時、準確的診斷和有效的治療，不僅有利于患者健康，而且對消除傳染源、控制結核病流行起重要的作用。近年來結核性膿胸的發病有所增加，并且出現了耐藥菌，通過外科手術治療方法對患者的病灶給予清除，以達到縮短療程、治愈的目的[6-9]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥[10，11]，其起效快，作用時間短，且麻醉后舒適感較好，是胸外科結核性膿胸患者靜脈麻醉首選藥物，還廣泛用于無痛腸鏡、無痛胃鏡檢查以及無痛人工流產術和重癥監護室鎮靜等。近年來，丙泊酚濃度測定及藥物代謝動力學研究較多，測定丙泊酚血藥濃度對指導臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[12]、氣-質聯用（GC/MS）[13]、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）[14]。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強、所需樣品量少，但儀器設備較昂貴，難以普及推廣。在高效液相色譜法中，電化學和二極管陣列檢測法國內應用較少。目前文獻報道的高效液相色譜法主要有高效液相-紫外檢測法（HPLC UV）、高效液相-熒光檢測法（HPLC Flu）。為適應臨床藥代動力學研究的需要，本實驗室經過色譜條件、內標確立和流動相的選擇、方法專屬性實驗等研究建立測定人血漿中丙泊酚濃度的方法，以2，4-二叔丁基苯酚為內標高效液相色譜法測定丙泊酚濃度。

本實驗以2，4-二叔丁基苯酚為內標高效液相色譜法測定丙泊酚血漿藥物濃度，該方法簡單、易行、可重復。雖然質譜法檢測丙泊酚血藥濃度在很多研究中使用，但由于質譜設備昂貴，很多實驗室還沒有該設備[15，16]。研究報告顯示高效液相色譜法甚至可以與質譜法達到相近的定量下限[17]。

本實驗樣品預處理方法選擇乙腈-甲醇（75∶25）混合液蛋白沉淀法，較萃取法簡單，并且不需要大量的有機溶劑如環己烷、氯仿-乙酸乙酯混合液[18，19]，也不需要花費昂貴的試劑盒[14]。流動相選用水（H3PO4 調pH=1.8）-乙腈（70∶30）時，丙泊酚和2，4-二叔丁基苯酚內標出峰時間合理，色譜峰形理想，而當采用三氟乙酸調節水pH值時，雖然出峰時間合理，但色譜圖中基線不穩定。血中代謝物質和其他內源性物質的峰均不干擾丙泊酚的測定，說明該方法具有較高的專屬性。

本方法測定丙泊酚濃度方便快捷，一天可以檢測完10例患者的100個血樣，臨床樣品測定結果表明，丙泊酚2 mg/kg 靜脈注射后2、4、6、8、10、15 min的平均血藥濃度與吳健等[20]報道的接近。該法檢測到最低濃度為0.2970 mg/L，靈敏度高，可滿足臨床藥動學研究需要，為開展血藥濃度檢測、藥代學研究提供方法學依據。

總之，以2，4-二叔丁基苯酚為內標高效液相色譜法測定丙泊酚在結核性膿胸患者血漿藥物濃度可行、方便，準確，能夠為臨床合理使用該藥物提供依據。

[參考文獻]

[1] 吳健，何慧梁，祝勝美，等.原位肝移植患者術中不同時期異丙酚血藥濃度的變化[J].中華麻醉學雜志，2004， 24：264-267.

[2] Adeishvili-Andguladze LV，Makharadze RV，Kurtsikidze MSh，et al. Investigation of conjugation and metabolism of propofol with the method of high performance liquid chromatography[J]. Georgian Med News，2009（169）：98-100.

[3] Song JC，Sun YM，Zhang MZ，et al. Propofol pharmacokinetics in patients with obstructive jaundice[J]. Curr Drug Deliv，2009，6（3）：317-320.

[4] Smuszkiewicz P，Wiczling P，Przybyowski K，et al. The pharmacokinetics of propofol in ICU patients undergoing long-term sedation[J]. Biopharm Drug Dispos，2016，37（8）：456-466.

[5] World health Organization. Global Tuberculosis Report 2014[M]. Geneva：World Health Organization，2014：237-246.

[6] Park SK，Lee CM，Heu JP，et al.A retrospective study for the outcome of pulmonary resection in 49 patients with multidrug-resistant tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis，2002，6（2）：143-149.

[7] Shiraishi Y，Nakajima Y，Katsuragi N，et al.Resectional surgery combined with chemotherapv remains the treantment of choice for multidrug-resistant tuberculosis[J]. J Thorac Cardiovasc Surg，2004，（128）：523-528.

[8] 張培元.肺結核診斷和治療指南[J].中華結核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74.

[9] 于大平，傅瑜. 耐多藥肺結核133例外科治療效果探討[J].中華結核和呼吸雜志，2009，32（6）：450-453.

[10] 陳蘭鳳，張瑞東，朱邵軍，等.瑞芬太尼復合丙泊酚或七氟烷對小兒扁桃體切除術術后躁動的影響[J]. 中國現代醫生，2016，54（6）：84-87.

[11] 韓利平，邵紅玲，宋美麗. 不同初始劑量丙泊酚在無痛胃鏡麻醉中的效果探討[J]. 中國現代醫生，2016，54（31）：103-110.

[12] Kivlehan F，Chaum E，Lindner E. Propofol detection and quantification in human blood：The promise of feedback controlled， closed-loop anesthesia[J].Analyst，2015，140（1）：98-106.

[13] Colucci AP，Gagliano-Candela R，Aventaggiato L.Suicide by self-administration of a drug mixture（propofol，midazolam，and zolpidem）in an anesthesiologist：the first case report in Italy[J]. J Forensic Sci，2013，58（3）：837-841.

[14] Cohen S，Lhuillier F，Mouloua Y，et al. Quantitative measurement of propofol and in main glucuroconjugate metabolites in human plasma using solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007， 854（1-2）：165-172.

[15] Bajpai L，Varshney M， Seubert CN，et al. A new method for the quantitation of propofol in human plasma：Efficient solid phase extraction and liquid chromatography/APCI-triple quadruple mass spectrometry detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2004， 810（2）：291-296.

[16] Miekisch W，Fuchs P，Kamysek S，et al. Assessment of propofol concentrations in human breath and blood by means of HS-SPME-GC-MS[J]. Clin Chim Acta，2008， 39：32-37.

[17] Yarbrough J，Harvey R，Cox S. Determination of propofol using high performance liquid chromatograhpy in whole blood with fluorescence detection[J]. J Chromatogr Sci，2012，50（3）：162-166.

[18] Dawidowicz AL，Kalityński R. HPLC investigation of free and bound propofol in human plasma and cerebrospinal fluid[J]. Biomed Chromatogr，2003，17（7）：447-452.

[19] Klausz G，Róna K，Kristóf I，et al. Evaluation of a fatal propofol intoxication due to self administration[J].J Forensic Leg Med，2009，16：287-289.

[20] 吳健，王珊娟，杭燕南. 老年和青壯年病人異丙酚全麻誘導的藥代動力學比較[J]. 中華麻醉學雜志，2002， 22：645-649.

（收稿日期：2017-05-03）