Nm23-H1核內定位對人肺腺癌A549細胞增殖的影響

盛亞 熊艷麗 許明芳 況勛杰 王東 楊雪琴

腫瘤轉移抑制基因Nm23-H1是第一個被分離鑒定出的與腫瘤轉移相關的抑制基因。大量的基礎研究表明，Nm23-H1能夠逆轉包括肺癌在內的多種惡性腫瘤的轉移潛能。因此理論上其表達的高低與肺癌患者的預后應該成正相關。但越來越多的臨床研究發現，Nm23-H1在肺癌的高表達并不都提示好的預后[1]。甚至有研究[2]發現其在鱗癌的表達反而與預后負相關。張志敏等[3]通過免疫組化研究發現在30例手術切除肺癌標本中，24例標本Nm23-H1的表達都以胞漿表達為主，但有6例標本存在Nm23-H1的胞核表達，而這6例患者均較早的出現局部復發或遠處轉移。同樣在Kim等[4]的研究中也發現在頭頸部鱗癌中，20%的患者存在Nm23-H1的胞核表達，而核高表達的Nm23-H1與較差的預后（OR=7.48）以及疾病的早期復發（OR=3.02）相關，這提示Nm23-H1除具有抑制腫瘤轉移的抑癌基因特性外，可能還具有癌基因潛能，而這兩種特性可能與Nm23-H1在胞漿胞核不同的定位有關。現有的基礎研究均以過表達或抑制胞漿Nm23-H1為研究手段，研究結果并不能真實反映或重復臨床中Nm23-H1以胞核定位為主細胞的實際生物學效應。因此，本研究構建了核內定向表達載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，轉染人肺腺癌A549細胞后觀察細胞增殖變化，以期探討胞核Nm23-H1對肺癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑 人肺腺癌A549細胞株由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心保存并傳代培養；大腸桿菌E. coli DH5α、293FT細胞由本實驗室保存；DMEM培養基、小牛血清購自Gibco公司，胎牛血清購自Life Technologies公司；pLentis-CMV-IRES2-PURO載體購自美國Invitrogen公司產品；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Omega公司；限制性內切酶、DNA聚合酶購自Takara公司；DNA連接酶購自Promega公司；兔抗人Nm23-H1抗體、兔抗人β-tublin購自美國Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人Lamin A/C購自Bioworld Technology公司；CCK-8（Cell counting kit-8）購自碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京大學人類疾病基因研究中心。

1.2 細胞培養 A549細胞用含10%小牛血清、鏈霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM培養基，37oC、5%CO2條件下培養，每3天傳代1次。0.25%胰酶常規消化，選擇生長良好的對數期細胞進行實驗。

1.3 Nm23-H1（NME1）表達載體構建、慢病毒包裝及細胞轉染 根據Nm23-H1設計PCR引物以擴增Nm23-H1（NME1）CDS序列。上游引物：TTAGGATCCacc ATGaagcgacctgccgccacaaagaaggctggacaggctaagaagaagaaa ATGGCCAACTGTGAG；下游引物：GCACTCGAGTTA AGCATAATCTGGAACATCATATGGATATTCATAGATC CAGTTCT。其中上游引物帶有BamHI酶切位點以及核定位信號NLS序列，下游引物帶有XhoI酶切位點以及HA tag序列。反應條件為：98oC、1 min，98oC、10 s，60oC、20 s，72oC、180 s，30個循環后，72oC延長3 min。PCR產物膠回收，獲得回收產物NME1，載體連接后，感受態轉化，提取質粒，按OMEGA質粒提取試劑盒說明書操作，用BamHI酶切驗證，正確的質粒送測序，測序引物為：AACAACTCCGCCCCATTGAC。酶切鑒定及測序均驗證均正確。在293FT的培養板中加入氯喹至終濃度25 μM，加入滅菌水及以下質粒（pMD2.G 1.5 μg+pSPAX2 4.5 μg+pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO 6 μg），總體積為263 μL，然后加入2 mol CaCl237 μL，混勻，最后再加入300 μL 2×HBS，邊滴加邊振蕩，迅速將混合物加入到細胞培養孔中，輕輕搖晃混勻。將培養基換為2 mL新鮮DMEM培養基，收集培養皿中的上清，500 g離心10 min，然后將上清用0.45 μm濾器過濾，置于-70oC保存。將培養的目的細胞消化計數后按 2×104/孔鋪于24孔板中，24 h后，分別加入對照病毒以及表達病毒，各250 μL，24 h后，棄去孔內培養基，加入新鮮的DMEM培養基500 μL，待細胞生長至80%融合度左右，將細胞消化并傳入6孔板中，24 h后，吸取孔內培養基，換為含有合適濃度puromycin的DMEM培養基，待細胞長滿后，消化收集細胞，穿入培養瓶中擴大培養。

1.4 蛋白質印跡法檢測Nm23-H1的定位及表達 慢病毒穩定轉染后的A549用細胞核/胞漿細胞組分提取試劑盒（Nuclear/Cytosol Fractionation Kit）分別提取胞漿蛋白及胞核蛋白。制作5%的濃縮膠和12.5%的分離膠，電泳后轉至PVDF膜，然后使用封閉液（含15%脫脂奶粉的TBs液）封閉1 h，Nm23-H1抗體按1:1,000比例稀釋（稀釋液為含0.05%Tween的TBS液），4oC孵育過夜。加標記了辣根過氧化物酶（herseradish peroxidase, HRP）的生物素二抗，按1:2,000-1:4,000比例稀釋，室溫輕搖孵育1 h，采用電化學發光法顯影。

1.5 激光共聚焦檢測Nm23-H1的定位及表達 分組處理A549細胞后移除培養基，取出已經貼壁的蓋玻片，以0.01 mol的PBS沖洗，5 min一次，重復沖洗3次；2%甲醛/PBS溶液在室溫條件下固定30 min，用PBS沖洗，沖洗步驟同前；加0.5% Triton X-100放置室溫15 min，用PBS沖洗，沖洗步驟同前；以30 mL/L的山羊血清工作液于37oC封閉30 min，吸掉封閉液；在載玻片上滴加 20 μL鼠抗人Nm23-H1單克隆抗體（稀釋度1:1,000）溶液，蓋玻片細胞貼壁面與抗體接觸，4oC孵育過夜；加入含有DAPI核染料于37oC孵育10 min。PBS沖洗同前，自然晾干切片，以緩沖甘油封片，以PBS替代一抗作為陰性對照；在Leica TCS SP激光共聚焦顯微鏡下觀察和掃描，以軟件ZEN 2012分析。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖情況 A549細胞經nNME1（Nm23-H1核過表達）或Control-nNME1轉染培養12 h-24 h后，同A549細胞一起參照CCK-8試劑盒說明，取2,000個/孔接種至96孔培養板，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后棄去上清液，每孔加入含10 μL CCK-8的無血清培養液，再繼續培養2 h后轉移培養上清液至96孔平底比色板，根據調零孔調零，用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度（OD）值，繪制細胞增殖曲線。每組平行做5個復孔，實驗重復3次。

1.7 細胞周期分析 細胞周期檢測管加入80%冷乙醇固定后4oC過夜，冷PBS沖洗去除固定液，離心棄上清，加入300 μL PBS，10 mg/mL的核糖核酸酶A（RNase A）溶液15 μL混勻，37oC孵育30 min，加1 mg/mL的PI染液混勻，暗室中放置30 min后轉入流式管進行熒光檢測。采用ModFit LT軟件分析細胞周期各時相的特點。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0進行數據分析。每項實驗均獨立重復3次，結果以Mean±SD表示，各組間結果數據進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗分析并作圖。以P＜0.05作為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 核內定向表達載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO的構建及轉染 重組載體質粒酶切鑒定及測序結果：質粒用BamHI酶切驗證，切出3,400 bp及2,200 bp的片段，所用Marker為Takara的1,000 bp DNA Ladder（圖1），正確的質粒送測序，測序引物為CMV-F：AACAACTCCGCCCCATTGAC，測序均驗證正確。載體示意圖如下：pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO（圖2）。采用蛋白質印跡及激光共聚焦檢測其Nm23-H1蛋白的定位及表達變化。蛋白質印跡及激光共聚焦結果顯示未轉染組和空載體組Nm23-H1蛋白以胞漿表達為主，而轉染組（A549 nNME1）所標記了的在胞漿胞核都有表達，但主要以胞核表達為主，表明我們成功構建并轉染了載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，Nm23-H1蛋白在A549細胞核內成功過表達（圖3）。

圖 1 重組質粒pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO酶切鑒定結果Fig 1 Results enzyme digestion analysis of recombinant plasmid. pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO. M: 1,000 bp DNA Marker. Lane 1-2: pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO.

圖 2 pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO表達載體Fig 2 Recombinant plasmid pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO

2.2 Nm23-H1核內定向表達對A549細胞增殖的影響CCK-8法檢測結果顯示，空載體組與空白對照組相比，二者增殖速度相當，無明顯差異，Nm23-H1核過表達組增殖速度快于對照組和空載體組，與空載體組相比在72 h（t=6.223,6, P＜0.000,1）、96 h（t=11.501,8, P＜0.000,1）和120 h（t=10.818, P＜0.000,1），差異有統計學意義（圖4）。

圖 3 載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO轉染后A549細胞中Nm23-H1蛋白的定位及表達。A：Nm23-H1蛋白在A549細胞中以胞漿表達為主，轉染組帶有HA標簽的Nm23-H1蛋白在胞漿和胞核均檢測到，但主要以胞核表達為主。β-tublin和Lamin A/C作為內對照；B：Nm23-H1蛋白主要位于A549細胞的胞漿，轉染后其在細胞核表達明顯增多；1：A549；2：A549空載體組；3：A549 nNME1轉染組。Fig 3 Nm23-H1 positioning and expression after stably transfected A549 cells by pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO. A: Nm23-H1 was mainly localized in the cytoplasm of A549 cells, Nm23-H1 with HA tag was detected in cytoplasm and nucleus of A549 nNME1 transfected and mainly localized in nucleus. β-tublin and Lamin A/C served as an internal control; B: Nm23-H1 was mainly localized in the cytoplasm of A549 cells and its nuclear localization significantly increased after transfected; 1: A549; 2: A549 vector only transfected; 3: A549 nNME1 transfected.

2.3 Nm23-H1核內定向表達對A549細胞周期的影響 流式細胞儀分析結果顯示，空載體組A549細胞G0期/G1期所占比例為35.69%，高于A549 nNME1轉染組的28.28%，差異不具有統計學意義（t=1.461, P=0.217）；而轉染組細胞G2期/M期百分比為58.7%，空載體組A549細胞百分比31.30%，差異具有統計學意義（t=4.560, P=0.010）；空載體組A549細胞S期所占比例為29.53%，轉染組細胞S期所占比例為11.21%，差異有統計學意義（t=4.427, P =0.011）。提示空載體組細胞主要分布在G0期/G1期，而轉染組細胞則主要分布于G2期/M期（表1）（圖5）。

表 1 Nm23-H1核內定向表達對A549細胞周期的影響（mean±SD, n=3）Tab 1 Nm23-H1nuclear directional expression effect on A549 cell cycle (mean±SD, n=3)

3 討論

圖 4 CCK-8法檢測Nm23-H1核過表達對A549細胞增殖的促進作用。***P＜0.000,1，n=3。Fig 4 The nuclear Nm23-H1 promotes A549 cells proliferation in vitro was detected by cell counting kit-8 (CCK-8). ***P＜0.000,1, n=3.

圖 5 A549、A549空載體組和A549 nNME1轉染組的細胞周期檢測。A：A549、A549空載體組和A549 nNME1轉染組細胞的流式細胞術周期檢測結果，a：A549；b: A549空載體組；c：A549 nNME1轉染組；B：轉染組細胞在G2期/M期所占比例（58.7%）明顯高于空載體組（31.30%）和未轉染組（30.7%）。* P＜0.05。Fig 5 Changes in the level of cell cycle in A549, A549 vector only transfected and A549 nNME1 transfected group cells. A: The flow cytometry results showed the cell cycle of A549, A549 vector only transfected and A549 nNME1 transfected group cells; a: A549; b: A549 vector only transfected; c: A549 nNME1 transfected; B：The cell circle distribution of A549 nNME1 transfected (58.7%) was significantly higher than those of A549 vector only transfected (31.30%) and A549 cells (30.7%). *P＜0.05.

腫瘤細胞的擴散及轉移的發生、發展是一個多基因、多步驟的復雜過程，涉及抑癌基因表達下降、缺失或功能失活和相關癌基因的過量表達或功能失常。Nm23-H1作為轉移抑制基因，對此過程的多個環節都具有調節功能。它能降低腫瘤細胞的運動力、侵襲力，同時促進細胞分化[5]。理論上其表達越高，肺癌的的預后越好，但臨床實際情況并非如此。Wang[1]采用RT-PCR檢測了141例非小細胞肺癌組織Nm23-H1 mRNA表達，發現Nm23-H1表達的高低與預后無關。而Gazzeri等[2]進一步發現鱗癌中Nm23-H1蛋白的高表達與腫瘤病程進展具有相關性，即表達越高，預后越差。這說明Nm23-H1在肺癌中可能存在雙面效應，即抑癌基因效應與促癌基因效應。在其他腫瘤中，Li等[6]報道在老年喉癌患者中，Nm23-H1與預后較差以及疾病復發顯著相關（P=0.000,9）。同樣在宮頸癌[7]以及血液腫瘤[8]的臨床研究也發現，Nm23-H1的表達越高，預后越差。這進一步提示Nm23-H1存在雙面效應的可能性。

Nm23-H1有可能存在雙面效應，而這種雙面效應可能與其胞漿胞核不同的定位有關。Subramanian等[9]報道EB病毒核抗原3C（EBNA3C）與Nm23-H1結合后，將促使Nm23-H1從胞漿轉移至胞核，同時研究還發現Nm23-H1轉位后，其抑制腫瘤轉移的特性不僅被EBNA3C廢除，反而還增加了EBNA-3C的轉錄活性。Kaul等[10]發現在EBNA3C蛋白誘導下進入胞核后，同樣也表現為促進腫瘤生長效應。因此本研究首次以連接核引導信號肽的Nm23-H1構建在胞核定位為主的肺癌細胞系，即構建并轉染了載體pLentis-CMV-NME1-IRES2-PURO，使Nm23-H1蛋白在A549細胞核內定向表達。此次核定位信號NLS序列aagcgacctgccgccacaaagaaggctggacaggctaagaagaa gaaa，翻譯的氨基酸為Lys、Arg、Pro、Ala、Ala、Thr、Lys、Ala、Gly、Gln、Ala、Lys、Lys、Lys、Lys，從而組成核定位信號肽。已知多數核蛋白是通過importin α/β異源二聚體運載系統被轉運到細胞核內，以此方式入核的蛋白都有羧基端核定位信號肽（nuclear localization signal sequence, NLS），importin α可識別NLS，并形成被運載蛋白-importin α-importin β的三聯復合物，將入核蛋白轉運至胞核內。我們此次的入核蛋白也有同樣的核定位信號肽，但它是否是通過importin α堆運載系統入核，還尚無定論。細胞增殖實驗表明，Nm23-H1核過表達的A549細胞在72 h、96 h和120 h時增殖率均大于空載體組的細胞增殖率，且有統計學意義。因此研究結果表明Nm23-H1核過表達對人肺腺癌A549細胞不再是抑癌作用，相反以促癌效應為主。這一結果與單純胞漿過表達Nm23-H1蛋白是不同的，也是本研究的意義所在，證明了入核后的Nm23-H1蛋白可能起到了其同源異構體Nm23-H2的癌基因潛能作用[6]。

既往研究表明，在人肺腺癌A549細胞胞漿中過表達Nm23-H1蛋白，可抑制腫瘤細胞的增殖，使G1期細胞增加而S期細胞減少，停滯于G0期，從而抑制體外培養的A549腫瘤細胞的增殖[11]。我們早期研究也發現，紫杉酵脂質體對Nm23-H1 siRNA轉染A549細胞周期的影響提示Nm23-H1低表達組在紫杉醇脂質體作用于主要將細胞阻滯于G2期/M期，以增強紫杉醇脂質體對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用[12]。以上研究表明胞漿過表達Nm23-H1蛋白對于人肺腺癌A549細胞的周期影響是主要將細胞阻滯在G0期/G1期，從而抑制腫瘤細胞增殖，而在紫杉酵脂質體作用下的A549細胞則是因Nm23-H1的低表達被阻滯于G2期/M期而抑制細胞增殖。本研究發現在胞核過表達Nm23-H1蛋白，空載體組細胞主要分布在G0期/G1期，而轉染組細胞則主要分布在G2期/M期。本研究中Nm23-H1核內的定向表達組細胞則主要分布在G2期/M期，與主要分布在G0期/G1期空載體組相比，促進了細胞的增殖。說明Nm23-H1可能主要通過影響細胞周期來產生促癌效應。

目前已有研究提示Nm23-H1具有促進腫瘤細胞增殖、轉錄調控活性及潛在的促癌作用，但大部分來源于病毒癌蛋白的作用[9,13]，且至今尚缺乏直接證據。曾有研究者分析認為，Nm23-H1之所以不再具有抑制腫瘤轉移的特性及促生長作用，其原因可能是由于病毒致癌蛋白與Nm23-H1的結合封閉了Nm23-H1的激酶活性位點，影響其在胞漿胞核的分布。其詳細的作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建核內定向表達載體pLentis-CMV-NME1-IRES2- PURO，發現了人肺腺癌核內定向表達Nm23-H1使細胞主要分布在G2期/M期并促進了A549細胞的體外增殖。但核內定向表達Nm23-H1以直接或間接的方式激活下游與增殖相關基因的表達，從而發揮促進肺癌增殖的作用途徑和作用機制尚待進一步研究闡明。