PAQR3在肺癌中的表達及其臨床意義

梁曉輝 孫保存 韓繼媛 趙秀蘭 劉增輝

肺癌是目前世界上發病率和致死率第一位的惡性腫瘤，也是我國境內最常見的惡性腫瘤之一。據國家癌癥中心發布的數據顯示，2009年至2011年我國肺癌患病率是733.3（1/10萬）。其中男性509.3（1/10萬），居惡性腫瘤的第1位。女性224（1/10萬），居惡性腫瘤第2位[1]。而有57%的患者在初診時已經發生了遠處轉移，導致晚期肺癌患者死亡的主要原因是侵襲和轉移[2,3]，因此深入了解肺癌的發生、發展和侵襲機制，研究新型靶向治療藥物，抑制肺癌的侵襲和轉移，對于提高治療效果、延長患者生存期尤其重要。新近研究發現孕酮及脂聯素受體家族成員3（progesterone and adiponectin receptor family member 3, PAQR3）隸屬于PAQR基因家族，是一種位于高爾基體上的七次跨膜蛋白。目前已有多項研究[4-7]證實PAQR3在多種惡性腫瘤中如乳腺癌、結直腸癌、胃癌、肝細胞癌、腎癌膀胱癌和骨肉瘤組織中發揮顯著的抑癌作用。PAQR3可以通過抑制細胞增殖、細胞惡性轉化、抑制血管生成及腫瘤轉移來影響腫瘤的發展[8]。研讀國內外文獻，有關PAQR3蛋白在肺癌組織，尤其是人的肺癌組織標本中的抑癌作用研究仍為空白。本研究即采用免疫組織化學染色的方法對肺癌組織中PAQR3蛋白的表達情況進行了檢測和分析，以進一步明確PAQR3與肺癌的病理特征及其預后的相關性，為優化肺癌的臨床診治方案提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集天津醫科大學總醫院病理科2008年1月-2010年12月經手術切除、臨床資料完整的肺癌病例106例，所有病例截止術前均未接受化療或放療，且無其他惡性腫瘤疾病，無嚴重肝、腎功能損害。106例肺癌組織標本均經HE染色，病理診斷明確。其中男性60例，女性46例，年齡30歲-70歲，平均年齡（47.5±6.4）歲；按照世界衛生組織（World Health Organization, WHO）（2015）肺腫瘤組織學分類，其中鱗癌37例，腺癌45例，小細胞癌15例，大細胞癌9例；腫瘤-淋巴結-轉移（tumor-node-metastasis, TNM）分期，I期20例，II期32例，III期31例，IV期23例；按組織學分級（不含腺癌），高分化10例，中分化16例，低分化35例（包括未分化）。其中伴有淋巴結轉移66例，未轉移40例。同時取各肺癌病例的癌旁正常組織作為對照。隨訪資料截止到2015年12月，8例患者失訪，隨訪率92.4%。1年、3年和5年生存率分別為81%、51%和42%。

1.2 免疫組織化學染色試劑與方法 常規使用中性福爾馬林固定，經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋后常規切片，厚度4 μm。放入65oC烤箱2 h，之后進行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，滴加抗原修復液進行修復抗原，后使用封閉液室溫封閉1 h，加入濃度為1:50的PAQR3抗體稀釋液（美國Santa Cruz公司），在恒溫培養箱中孵育2 h（37oC）。使用PBS沖洗并加入二抗稀釋液（美國Santa Cruz公司），在恒溫培養箱中孵育1 h（37oC）。之后使用PBS沖洗并加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，采用DAB顯色，蘇術精復染，顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學染色結果判定 所有染色標本由兩位病理診斷醫生在雙盲的情況下進行免疫組織化學染色的結果判定。判定標準：以細胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性細胞。按照陽性細胞率和染色強度兩個分級做為判定標準。以細胞漿染色強度分別計分：無著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色/棕黑色顆粒為3分；以細胞陽性范圍分別計分：＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；再將染色強度與陽性細胞率作乘積分級：＞3分為（+），6分-9分為（++），9分-12分為（+++），凡（+）或（+）以上者均為陽性表達。

1.4 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計數資料對比采用χ2檢驗，生存情況分析采用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAQR3蛋白在肺癌組織和正常肺組織中的表達 本研究中所有肺癌的診斷均經過術后HE染色結果證實，免疫組織化學染色（圖1）結果顯示PAQR3主要在細胞漿中表達，呈褐色。PAQR3在正常組織中陽性表達率為71%，呈現高表達，在肺癌組織中陽性表達率為35%，表達水平明顯較低。兩組表達的差異具有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

2.2 PAQR3的表達與肺癌臨床病理特征間的關系 肺癌患者PAQR3蛋白的陽性率在TNM分期、有無淋巴結轉移、病理分型以及分化程度方面差異具有統計學意義（P＜0.05），而年齡、性別、腫瘤大小的分布方面差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.3 PAQR3的表達與臨床預后之間的關系 Kaplan-Meier生存分析顯示，PAQR3陰性患者的5年中位生存時間為28.5個月，陽性患者的中位生存時間為45個月；PAQR3陽性表達者5年生存率明顯高于陰性表達者，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

肺癌是嚴重危害人類生命和健康的一種最為常見的惡性腫瘤，發病率和死亡率居高不下。近年來，隨著細胞生物學和分子生物學的不斷發展，對惡性腫瘤尤其肺癌的發病、侵襲和轉移機制的研究取得了不少的成果。但是肺癌的發病率和死亡率仍沒有明顯的降低。因此，探討和研發新的診療措施勢在必行。肺癌具有多種癌基因參與、多種抑癌基因發生變化、分階段變化的獨特的生物學行為特點，因此我們應該更多的從分子生物學角度去探討發病機制和侵襲轉移的機制，從而研發新的分子靶向治療藥物。

圖 1 肺癌和癌旁正常肺組織中PAQR3的表達（免疫組化染色，A、B：200×，C、D：100×）。A、C：肺癌組織中PAQR3的陰性表達；B、D：正常肺組織中PAQR3的陽性表達（箭頭所示）。Fig 1 The expression of PAQR3 in lung cancer and adjacent normal tissues (IHC,A,B: 200×; C,D: 100×). A,C: Negative expression of PAQR3 in lung cancer tissue; B,D: Positive expression of PAQR3 in adjacent normal tissues.

圖 2 PAQR3表達量與肺癌患者5年生存率之間的關系Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of the expression of PAQR3 in 106 patients with lung cancer

PAQR3基因隸屬于PAQR家族，位于染色體4q21.21上，在大多數物種里編碼同一種蛋白，具有高度保守性。PAQR3蛋白定位于高爾基體上，是一種具有III型拓撲結構的七次跨膜蛋白，其N端朝向細胞質一側、C段朝向高爾基體腔內，負責傳遞和調控胞內信號的作用。由于其最初被發現可以將細胞內游離的Raf激酶錨定在高爾基體上，使其不能被上游分子激活并且失去活化下游分子MEK的能力，因此又被稱為RKTG（Raf kinase trapping to Golgi）。在機體內的肝臟、腎臟、腦、乳腺和睪丸組織中均存在高表達[9,10]。已有研究[4-8]證實PAQR3在結直腸癌中發揮了抑癌作用，除此之外也被證明在多種腫瘤組織如乳腺癌、胃癌、肝細胞癌、腎癌膀胱癌和骨肉瘤組織中表達降低。眾所周知RAS/RAF/MEK/ERK信號通路在腫瘤組織中持續激活，負向調控此條信號通路可對腫瘤細胞的增殖和侵襲產生明顯的抑制作用，同時也會加速腫瘤細胞凋亡[11]。PI3K/AKT信號通路同樣在腫瘤組織中持續激活，抑制PI3K/AKT通路的活性可以顯著抑制腫瘤的增殖和促進凋亡[7]。那么PAQR3抑癌的最重要的機制是其能夠負性調控RAS/RAF/MEK/ERK信號通路和PI3K/AKT信號通路的活化[12]。另有研究[13]發現，過表達PAQR3可通過上調P27KIPI蛋白表達，降低Cyclin D1蛋白的表達，從而影響細胞的周期，導致腫瘤細胞進入S期的比例減少，處于G0期/G1期的比例增加。使用SiRNA干擾下調細胞內的PAQR3表達后，P27KIPI蛋白表達明顯減少，Cyclin D1蛋白則顯著增加。而研究證實過表達PAQR3還可以明顯降低基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9, MMP9）的表達，而MMP9可以特異性的降解細胞外基質，從而促進腫瘤細胞的轉移和浸潤中，這可能也是PAQR3抑制肺腫瘤細胞轉移和浸潤的機制之一[14]。PAQR3參與了腫瘤發生與發展過程中的多條信號通路的調節，在抑制腫瘤侵襲與轉移的生物學行為中起到了重要的作用。因此，我們推測PAQR3可能在肺癌患者的腫瘤組織中也同樣存在異常表達并對患者預后產生重要影響。因此深入分析PAQR3在肺癌組織中的表達對腫瘤的發生、侵襲和轉移的影響，對臨床診療及研發新的分子治療靶點都具有重要意義。

表 1 肺癌組織和癌旁正常組織中PAQR3陽性表達結果分析Tab 1 The expression of PAQR3 in the lung cancer and normal tissue

表 2 PAQR3的表達與肺癌臨床病理特征之間的關系Tab 2 Expression of PAQR3 in lung cancer and its relationship with several clinical pathological parameters

本研究結果證實PAQR3在正常肺組織中的表達顯著高于肺癌組織，提示PAQR3的正常表達在肺癌的發生發展過程中發生了重大改變。PAQR3的表達率與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小沒有相關性，但是與肺癌患者的病理分型以及分化程度具有顯著的相關性，惡性度越高，分化程度越低，PAQR3的陽性表達率越低，提示PAQR3的表達與腫瘤的生物學行為有密切的關系，同時其在肺癌中的陽性表達率與患者的臨床分期以及有無淋巴結轉移具有顯著相關性，中晚期和有淋巴結轉移的患者陽性表達率顯著降低，這強有力的證實PAQR3參與抑制了肺癌的增殖和侵襲轉移。進一步生存分析發現，PAQR3的陽性表達率與患者的預后存在著顯著相關性，PAQR3陽性表達者5年生存率明顯高于陰性表達者，推測肺癌組織中PAQR3的表達可以作為評估預后的重要參考指標。在體外細胞實驗和動物體內實驗中，己經證實過表達PAQR3可以顯著抑制腫瘤細胞的克隆形成、體外增殖及體內成瘤能力[15]。因此，結合以往研究和本實驗結果，我們推測PAQR3在抑制肺癌的發生、發展和侵襲中發揮重要的作用。

總之，PAQR3在肺癌組織中的表達受到明顯抑制，與腫瘤的生物學行為、臨床分期及患者預后存間在顯著相關性，在術后檢測肺癌腫瘤組織標本中的PAQR3對于評估患者預后具有重要意義，另外，開發靶向作用于PAQR3的藥物也可能會給肺癌的治療帶來新的思路和方法。