蜜蜂主要病毒病在遼寧的分布與感染差異

袁春穎鄧 帥楊大賀李 飛王新齡刁青云

（1遼寧省畜產品安全監察所，興城125100；2中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂主要病毒病在遼寧的分布與感染差異

袁春穎1鄧 帥2楊大賀2李 飛2王新齡2刁青云2

（1遼寧省畜產品安全監察所，興城125100；2中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂病毒是危害蜂群健康發展的重要隱性感染因素。自在遼寧省部分地區發現并鑒定黑蜂王臺病毒以來，為深入了解蜜蜂病毒在遼寧省的分布及感染程度的差異，分別在5個地區采集蜂樣，對8種蜜蜂病毒在遼寧省主要蜜蜂飼養區的發生與流行進行調查，為進一步研究蜜蜂病毒在遼寧省的傳播與流行規律提供基礎數據，更為探討病毒的防治提供技術支持。

蜜蜂病毒；流行與分布；感染差異

1 引言

蜜蜂病毒主要是屬于小核糖核酸病毒家族的一類小RNA病毒[1]。該家族病毒的最主要特點之一是具有較強的隱性感染，無明顯的癥狀表現。自去年在遼寧省發現黑蜂王臺病毒（BQCV）以來，不少蜂場均出現大量死亡或爬蜂現象，而最近通過實地蜂樣發現其病毒病的感染可能性較大。因此，有必要對遼寧省主要地區的病毒進行調查。蜜蜂病毒在世界范圍內的流行與發生都有相關報道，尤其是在西方國家。在對歐洲膜翅目昆蟲RNA病毒的調查中，發現DWV、黑蜂王臺病毒、囊狀幼蟲病毒及以色列急性麻痹病毒是最主要的病原，但是DWV的流行率最高[2]。雖然國內外大量學者已對DWV的基因組特點及組織傾向性進行了深度分析，并且就其傳播途徑及載體也進行了實驗研究。但是，過去幾十年間，DWV一直是主要病毒流行于歐美，如在1999～2004年間，在匈牙利蜂場篩選6個病毒的流行率，發現DWV達72%的檢測率[3]。同樣，在英格蘭、奧地利、法國、美國均被發現高于70%的流行率于蜜蜂群中[4]。隨后，瑞典學者發現，DWV與VDV的重組現象非常普遍發生在感染的蜜蜂中[5]。繼而又發現DWV基因組在蜜蜂與其寄生性瓦螨間能夠相互傳遞[6]。Ryabov等人對感染DWV的蜜蜂采用高通量測序研究發現DWV與VDV重組率相當高且能夠產生新型蜜蜂病毒[7]。隨后Tomas Erban也證實了感染DWV的蜜蜂能形成多個DWV復合病毒，且與瓦螨病毒等能夠形成新的毒力更強的病毒[8]。而最近Furst等的研究表明，DWV無論是在實地野外條件還是實驗室也高流行于熊蜂群中，并且闡明了如何在不同地理區域其感染率從高到低跨越物種傳播與進化的特點[9]。在我國，艾紅霞等調查了7個蜜蜂病毒在我國部分省份的蜂樣，發現DWV是最普遍的病毒[10]。楊莆等人對我國境內的中華蜜蜂和意大利蜜蜂都進行了7個病毒的流行，發現DWV在這兩個蜂種間均是最高感染病毒[11]。最近李繼蓮等對我國19個省的中華蜜蜂病毒感染情況進行了普查，發現黑蜂王臺病毒是最高感染者，但是DWV的感染率僅次于黑蜂王臺病毒[12]。

雖然西方較多國家與地區均檢測到黑蜂王臺病毒，并且發現BQCV是所有蜜蜂病毒中流行較為廣泛的病毒之一，但是關于BQCV在我國部分地區的發生與流行的報道相對較少。因此，本研究擬對遼寧省部分商業化飼養蜂群的主要病毒發生與流行進行初步調研，為進一步防治病毒病提供技術支持。

2 材料與方法

2.1 樣本采集

對遼寧省朝陽市、葫蘆島市、綏中、北票和本溪等5個不同地區近20個蜂場的健康蜂群（意大利）進行采樣，每群至少采集50～100只蜜蜂，采集的樣品迅速帶回實驗室或冷凍低溫保存。

2.2 病毒RNA提取

將大約10～20只蜜蜂置于50 ml無菌管中，采用組織勻漿設備進行研磨，至良好細末狀，加入適量的Trizol進行總RNA提取，室溫放置10分鐘后，于12000 rpm下離心15分鐘，取沉淀加入1 ml 75%酒精清洗，詳細步驟按Trizol總RNA提取試劑盒說明操作。將提好的總RNA溶解在20 μl的TE緩沖液或無菌水中并貯存于-20°C冰箱中備用。

2.3 RT-PCR擴增

以提取的總RNA為模板，以Takara反轉錄試劑盒進行反轉錄，先合成第一鏈cDNA，主要以2×Taq Mix（天根，北京）、引物及無菌水，其擴增反應體系總體積為20 ul：cDNA模板為1μl，上、下游引物各 1 μl（表1），反應緩沖液 10 μl，無菌水 7 μl。反應條件為：94℃3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30～33 個循環，72℃再延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 mg/ml溴化乙錠）進行檢測鑒定。

表1 本研究檢測病毒所用引物序列

3 結果

3.1 各地區感染率差異

通過對遼寧省5個不同地區的各類型病毒檢測發現，IAPV是遼寧省蜜蜂最主要的流行病毒，分布在檢測的4個地區，并且在葫蘆島地區其感染率高達80%。而在地區間病毒的總個數也非常明顯，葫蘆島市感染了8個病毒的3個病毒，分別為IAPV，DWV和VDV。其中本溪地區的蜜蜂主要感染CSBV，且感染水平低。

圖1 不同地區間病毒感染率的差異

3.2 區域間感染率的比較

為了深入理解病毒感染在區域間的差異，將朝陽、葫蘆島與北票歸為西部，將綏中歸為中部，本溪歸為東部。從采樣的區域來看，西部地區的蜂群感染病毒率明顯高于其它兩個地區，并且感染病毒的總數也明顯多于另兩個地區。

圖2 不同區域間感染病毒的差異

4 討論

本次對遼寧省主要蜜蜂飼養區域蜜蜂病毒病的發生、流行與分布進行了初步的調查。顯示不同地區間的病毒感染率與病毒總數具有明顯的差異，總體是西部與中部地區的感染率明顯高于東部地區。該結果表明不同地理特征區域可能對病毒的發生與流行具有明顯的影響，也可能生態氣候對病毒的流行或蜂群健康有影響，如東部地區有較好的生態與蜜源植物，為蜜蜂的健康發展提供了基礎食物來源。

本研究初步調查了蜜蜂病毒在遼寧省部分地區的分布與流行，為可能影響病毒的發生或進一步防治蜜蜂病毒提供借鑒。雖然本研究為病毒的發生提供部分數據，但是采樣的范圍及取樣的尺度仍需進一步擴大，以增加結果的全面性，為進一步分析病毒的流行與發生規律提供重要的基礎數據。

[1]Mayo M.A.Virus taxonomy[J].Arch Virol,2002,147(5):1071-1076.

[2]Furst M.A.,McMahon D.P.,Osborne J.L.,et al.Disease associations between honeybees and bumblebees as a threat to wild pollinators[J].Nature,2014,506(7488):364-366.

[3]Baker A.,Schroeder D.Occurrence and genetic analysis of picorna-like viruses infecting worker bees of Apis mellifera L.populations in Devon,South West England[J].J.Invertebr.Pathol.,2008,98(2):239-242.

[4]Berényi O.,Bakonyi T.,Derakhshifar I.,et al.Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries[J].Appl.Environ.Microbio.,2006,72(4):2414-2420.

[5]Tentcheva D.,Gauthier L.,Zappulla N.,et al.Prevalence and seasonal variations of Six Bee Viruses in Apis mellifera L.and Varroa destructor Mite Populations in France[J].Appl.Environ.Microbio.,2004,70(12):7185-7191.

[6]Nazzi F.,Brown S.,Annoscia D.,et al.Synergistic parasitepathogen interactions mediated by host immunity can drive the collapse ofhoneybee colonies[J].PLosPathogens,2012,8(6):e1002735.

[7]Runckel C.,Flenniken M.L.,Engel J.C.,et al.Temporal Analysis of the Honey Bee Microbiome Reveals Four Novel Viruses and Seasonal Prevalence of Known Viruses,Nosema,and Crithidia[J].Plos One,2011,6(6):e20656.

[8]Granberg F.,Vincente M.,Rubio C.,et al.Metagenomic detection of viral pathogens in Spanish honeybees:co-infection by Aphid Lethal Paralysis,Israel acute paralysis and Lake Sinai Viruses[J].PLos One,2013,8(2):e57459.

[9]Chen Y.P.,Pettis J.S.,Collins A.,et al.Prevalence and transmission of honeybee viruses[J].Appl.Environ.Microbio.,2006,72(1):606-611.

[10]Strauss U.,Human H.,Gauthier L.,et al.Seasonal prevalence of pathogens and parasites in the savannah honeybee(Apis mellifera scutellata)[J].J.Invertebr.Pathol.,2013,114(1):45-52.

[11]Singh R.,Levitt A.,Rajotte E.,et al.RNA viruses in hymenopteran pollinators:evidence of inter-taxa virus transmission via pollen and potential impact on Non-Apis Hymenopteran species[J].PLos One,2010,5(12):e14357.

[12]Ai H.,Yan X.,Han R.Occurrence and prevalence of seven bee viruses in Apis mellifera and Apis cerana apiaries in China[J].J.Invertebr.Pathol.,2012,109(1):160-164.

[13]Li J.,Qin H.,Wu J.,et al.The prevalence of parasites and pathogens in Asian honeybees Apis cerana in China[J].PLos One,2012,7(11):e47955.

[14]Maori E.,Tanne E.,Sela I.Reciprocal sequence exchange between non-retro viruses and hosts leading to the appearance of new host phenotypes[J].Virology,2007,362(2):342-349.

[15]Blanchard P.,Ribiere M.,Celle O.,et al.Evaluation of a realtime two-step RT-PCR assay for quantitation of Chronic bee paralysis virus (CBPV)genome in experimentally-infected bee tissues and in life stages of a symptomatic colony [J].J.Virological Methods,2007,141(1):7-13.

[16]Benjeddou M.,Leat N.,Allsopp M.,et al.Detection of acute bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR[J].Appl.Environ.Microbiol.,2001,67(5):2384-2387.

[17]Chen Y.,Pettis J.S.,Feldlaufer M.F.Detection of multiple viruses in queens of the honey bee Apis mellifera L.[J].J.Invertebr.Pathol.,2005,90(2):118-121.

[18]Fujiyuki T.,Matsuzaka E.,Nakaoka T.,et al.Distribution of Kakugo virus and its effects on the gene expression profile in the brain of the worker honeybee Apis mellifera L.[J].J.Virol.,2009,83(22):11560-11565.

Distribution and infection difference of honeybee viruses in Liaoning province

Yuan Chunying1,Deng Shuai2,Yang Dahe2,Li Fei2,Wang Xinling2,Diao Qingyun2
(1 The Original Bee Breeding Farm of Liaoning Province,Xingcheng 125100,China;2 Institute of Apicultural Research,CAAS,Beijing 100093,China)

Honeybee viruses are one of the most important factors impacting the colony health.To better understand the distribution and infection difference of honeybee viruses,we collected honeybee samples from 5 regions of Liaoning province and investigated the prevalence of 8 honeybee viruses in Liaoning.Our results will pay a foundation to prevent the honey bee viruses.

honeybee viruses;prevalence and distribution;infection difference

國家蜂產業技術體系專項經費（CARS-45-SYZ3）

袁春穎（1981-），女，高級畜牧師，從事養蜂生產技術研究及推廣工作，E-mail：chunying0914@163.com

刁青云，女，研究員，從事蜜蜂病害研究工作，E-mail:dqyun1@126.com