6種菊花抗氧化活性及總酚含量的研究

楊璐齊，陳冠林，俞憬，王煜坤，高永清，傅南琳

（1.廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山528458；2.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；3.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東廣州510008）

6種菊花抗氧化活性及總酚含量的研究

楊璐齊1，陳冠林2，俞憬1，王煜坤1，高永清1，傅南琳3，*

（1.廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山528458；2.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；3.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東廣州510008）

采用DPPH、ABTS和FRAP 3種方法測定了6種菊花的抗氧化活性并用福林-酚法測定其總酚含量。結果表明：依據其總酚含量和抗氧化活性，6種菊花均是很好的抗氧化劑來源。FRAP、DPPH和ABTS試驗顯示，黃金菊的抗氧化活性最強，其 FRAP、DPPH 和 ABTS 值分別為 150.22、125.19、173.47 μmol Trolox/g。此外，總酚測定結果表明，黃金菊的總酚含量最高。

抗氧化性；總酚；菊花

菊花（chrysanthemum），學名為Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel，為菊科（Asteraceae）植物菊花的干燥頭狀花序，是一種常見的藥食兩用的花卉，具有清熱、明目、疏風、解毒之功效[1-2]，可用于治療頭痛眩暈、風熱感冒、眼目昏花以及目赤腫痛。菊花在中國具有3 000多年的栽培歷史，按產地和加工方法的不同，分為“杭菊”、“貢菊”、“毫菊”、“懷菊”、“滁菊”、“祁菊”、“濟菊”和“黃菊”八大主流品種[3]。菊花的主要化學成分為黃酮類、單萜類、蒽醌類、倍半萜以及三萜類等化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤以及降血脂等多種生物學活性[4-7]。從目前掌握的文獻來看，雖然有不少人對菊花提取物及其抗氧化性進行了相關的研究[2，8-11]，但對菊花中酯化酚（esterified phenolics）以及難溶性酚（insoluble-bound phenolics）的研究較少。因此，本研究以菊花為原料，以一定比例的乙醇提取其中的游離酚（free phenolics）后，應用堿液對提取液及提取殘渣水解而獲得酯化酚和難溶性酚，測定其多酚含量，并系統地測定了菊花多酚的抗氧化活性，旨在為開發菊花多酚提供依據。

1 材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

6種菊花（杭白菊、黃金菊、胎菊、洋金菊、黃山貢菊、金菊花）：購于廣東省佛山市某市場。

1.1.2 試驗試劑

Trolox （6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素 E）、ABTS（2，2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2，2'-聯氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）以及福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent）：美國 Sigma公司；TPTZ（2，4，6-tris-2，4，6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）和 DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：阿拉丁公司；乙醇、FeCl3、HCl、乙酸鈉、過硫酸鉀、沒食子酸、乙醇（分析純）：天津化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV-9600紫外/可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；LEO-150S超聲清洗儀：昆山力波超聲波設備有限公司；ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀：美國Waters公司；HD-100高速多功能粉碎機：諸暨市海道機械有限公司；SY2000旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 樣品的制備

菊花購回后用粉碎機粉碎，過20目篩備用。

2 方法

2.1 酚類的水解

準確稱取1.00 g樣品，加入50 mL 40%乙醇，超聲波輔助浸提10 min后將提取液過濾，水相減壓蒸餾至20 mL左右后用6 mol/L HCl調pH至2，用乙酸乙酯（1∶1，體積比）萃取3次。乙酸乙酯相經混合減壓蒸餾（50℃）至干后溶于50%甲醇中，獲得游離酚（free phenolics）。于萃取游離酚后的水相中加入30 mL 4 mol/L NaOH，室溫下用氮吹儀吹入氮氣水解4 h，然后用 6 mol/L HCl調至 pH2，再用乙酸乙酯（1∶1，體積比）萃取3次，乙酸乙酯相經混合減壓蒸餾至干后溶于50%甲醇中，獲得酯化酚（esterified phenolics）。在開始過濾后的提取物殘渣中加入20 mL 4 mol/L NaOH，室溫下用氮吹儀吹入氮氣水解4 h，然后用6 mol/L HCl調至pH2，過濾后用乙酸乙酯（1∶1，體積比）萃取3次，乙酸乙酯相混合減壓蒸餾至干后溶于50%甲醇中，獲得難溶性酚（insoluble-bound phenolics）[12]。

2.2 總酚含量的測定

取0.10 mL待測樣品，加入2.50 mL Folin-Ciocalteu試劑中，反應4 min后，加入2.00 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應120 min，于760 nm下測定吸光度。結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位為 mg GAE/g[13-14]。

2.3 FRAP法測定抗氧化活性

FRAP試劑由10 mmol/L的TPTZ（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L的三氯化鐵、300 mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH3.6）以1∶1∶10（體積比）的比例混合而成。取100 μL待測樣品，加入3 mLFRAP溶液中充分混合，反應120 min后于593 nm處測定吸光度。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g 表示[15-16]。

2.4 DPPH法測定抗氧化活性

取0.1 mL待測樣品，加入0.06 mmol/L DPPH 80%乙醇溶液3.9 mL，振蕩15 s，放置暗處反應2 h后，于515 nm處測定吸光度，按以下公式計算清除率：

清除率/%=（A對照-A樣品）×100/A對照。式中：A對照為對照組的吸光度，A樣品為樣品的吸光度。

以3.9 mL DPPH+0.1 mL 80%乙醇作對照、80%乙醇作空白，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g[17]。

2.5 ABTS法測定抗氧化能力

將7 mmol/L的ABTS（用pH值為4.5、20 mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應12 h～16 h，形成ABTS儲備液。使用前用20 mmol/L乙酸鈉（pH4.5）將ABTS儲備液稀釋成為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.005。取100 μL待測樣品，加入3 mL ABTS工作液，室溫下反應2 h后，在734 nm處測定吸光度。以20 mmol/L乙酸鈉（pH4.5）為空白，ABTS工作液為對照，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）表示[15]，單位為μmol Trolox/g。

3 結果與分析

3.1 線性關系

多酚、FRAP、DPPH以及ABTS線性方程、相關系數和線性范圍見表1。

表1 多酚、FRAP、DPPH以及ABTS線性方程、相關系數和線性范圍Table 1 Linear equations，correlation coefficients and linear ranges of polyphenol content，FRAP，DPPH and ABTS

從表1可以看出，在測定范圍內多酚、FRAP、DPPH以及ABTS 4種測定方法具有很好的線性關系。

3.2 6種菊花中游離酚、酯化酚以及難溶性酚的含量

種菊花中游離酚、酯化酚以及難溶性酚的含量見表2。

表2 6種菊花中游離酚、酯化酚以及難溶性酚的含量Table 2 The phenolic contents of free phenolics，esterified phenolics，and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

從表2可知，6種菊花總酚含量差別較大，其中黃金菊的游離酚含量最高，其次是杭白菊、金菊花，而黃山貢菊的游離酚含量最低。黃金菊的酯化酚和難溶性酚含量也高于其他5種菊花。黃山貢菊的酯化酚酚含量最低，而胎菊的難溶性酚含量最低。6種菊花的游離酚含量均高于酯化酚和難溶性酚。杭白菊、黃金菊、洋金菊、黃山貢菊以及金菊花的難溶性酚含量高于酯化酚。Li等[18]研究發現，菊花游離酚含量高于難溶性酚。Xiong等[19]研究發現，杭白菊的游離酚含量高于難溶性酚，這與本研究的結果是一致的。而Kaisoon等[20]研究發現，珊瑚藤、葉子花、硫華菊、懸鈴花、龍船花、荷花以及萬壽菊的難溶性酚含量高于其游離酚。

3.3 游離酚、酯化酚以及難溶性酚的鐵離子還原能力

游離酚、酯化酚以及難溶性酚的鐵離子還原能力見表3。

表3 6種菊花游離酚、酯化酚以及難溶性酚的鐵離子還原能力Table 3 Ferric reducing antioxidant powers of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

從表3可知，各種菊花的抗氧化能力均較強。就游離酚而言，黃金菊的FRAP值最高，其次是杭白菊、金菊花，而洋金菊的FRAP值最低；就酯化酚而言，洋金菊的FRAP值最高，杭白菊的FRAP值最低；而對難溶性酚的測定結果是，洋金菊的FRAP值最高，其次是黃金菊、胎菊，金菊花的FRAP值最低。在測定的6種菊花中，游離酚的抗氧化能力均高于酯化酚和難溶性酚；黃山貢菊和金菊花酯化酚的FRAP值高于難溶性酚。Li等[18]研究發現，菊花游離酚的鐵離子還原能力高于難溶性酚；Xiong等[19]研究發現，杭白菊游離酚的鐵離子還原能力高于難溶性酚，這與本研究的結果是一致的。而萬壽菊游離酚的鐵離子還原能力低于難溶性酚[20]。

3.4 游離酚、酯化酚以及難溶性酚的DPPH自由基清除能力

游離酚、酯化酚以及難溶性酚的DPPH自由基清除能力見表4。

表4 6種菊花游離酚、酯化酚以及難溶性酚的DPPH自由基清除能力Table 4 DPPH radical scavenging activities of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

從表4可知，各種菊花對DPPH自由基的清除能力均較強。就游離酚而言，黃金菊對DPPH自由基的清除能力最強，其他依次是杭白菊、金菊花、黃山貢菊，洋金菊對DPPH自由基的清除能力最弱；就酯化酚而言，胎菊對DPPH自由基的清除能力最強，其次是洋金菊和黃山貢菊；而對難溶性酚的測定結果是，洋金菊對DPPH自由基的清除能力最強，黃山貢菊對DPPH自由基的清除能力最弱。在測定的菊花中，游離酚對DPPH自由基的清除能力均高于酯化酚和難溶性酚；杭白菊、黃金菊以及洋金菊難溶性酚對DPPH自由基的清除能力均高于酯化酚。研究發現，萬壽菊水溶性酚的DPPH自由基清除能力高于難溶性酚[20]。Wang等[21]研究發現，未經硫熏的菊花提取物有較高的DPPH自由基清除能力，其EC50值為0.079 mg/mL，而經硫熏后的菊花提取物對DPPH自由基的清除能力比未經硫熏的提取物低，其EC50值為0.085 mg/mL。菊花提取物還具有抗炎[22]、抗黑色素生成、抗氧化[23]以及抗糖尿病[24]等多種生物學活性。

3.5 游離酚、酯化酚以及難溶性酚的ABTS自由基清除能力

游離酚、酯化酚以及難溶性酚的ABTS自由基清除能力見表5。

表5 6種菊花游離酚、酯化酚以及難溶性酚的ABTS自由基清除能力Table 5 ABTS radical cation scavenging activities of free phenolics，esterified phenolics and insoluble-bound phenolics from 6 kinds of chrysanthemums

從表5可知，各種菊花對ABTS自由基的清除能力均較強。就游離酚而言，黃金菊對ABTS自由基的清除能力最強，其他依次是黃山貢菊、杭白菊以及胎菊，金菊花對ABTS自由基的清除能力最弱；就酯化酚而言，胎菊對ABTS自由基的清除能力最強，其他依次是洋金菊、黃山貢菊以及金菊花，杭白菊對ABTS自由基的清除能力最弱；就難溶性酚而言，洋金菊對ABTS自由基的清除能力最強，杭白菊對ABTS自由基的清除能力最弱。在測定的6種菊花中，游離酚對ABTS自由基的清除能力均高于酯化酚和難溶性酚；杭白菊、黃金菊、洋金菊、黃山貢菊以及金菊花難溶性酚對ABTS自由基的清除能力均高于酯化酚。Li等[18]研究發現，菊花游離酚對ABTS自由基的清除能力高于難溶性酚，其游離酚和難溶性酚的ABTS值分別為8.11 μmol Trolox/g和0.12 μmol Trolox/g，低于本研究的6種菊花。Xiong等[19]研究發現，杭白菊游離酚對ABTS自由基的清除能力高于難溶性酚，但其難溶性酚對ABTS自由基的清除能力低于本研究的杭白菊。

4 結論

本研究采用DPPH、ABTS和FRAP 3種方法分別測定了6種菊花的抗氧化活性，并用Folin-Ciocalteu法測定其總酚含量。結果表明，6種菊花表現出不同的抗氧化活性，其中黃金菊的抗氧化活性最強，總酚含量也最高。

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Antioxidant Activities and Total Phenolic Contents of Six Kinds of Chrysanthemum

YANG Lu-qi1，CHEN Guan-lin2，YU Jing1，WANG Yu-kun1，GAO Yong-qing1，FU Nan-lin3，*
（1.School of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan 528458，Guangdong，China；2.FoshanInstituteofOccupationalDiseasePreventionandControl，Foshan528000，Guangdong，China；3.TheFirstHospitalAffiliatedtoGuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510008，Guangdong，China）

DPPH，ABTS and FRAP methods were used to determine the antioxidant activities of six kinds of chrysanthemum[Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel]，and Folin-Ciocalteu method was used to determine their total phenolic contents.Results indicated that six kinds of chrysanthemum were significant sources of an－tioxidants in terms of their total phenolic contents and antioxidant activities.In FRAP，DPPH and ABTS assays，chamomile （Perennial chamomile）exhibited the highest antioxidant activity with the values of 150.22，125.19 μmol Trolox/g and 173.47 μmol Trolox/g respectively.In addition，in Folin-Ciocalteu assay，chamomile exhibited the highest total phenolic content.

antioxidant activity；total phenolic content；chrysanthemum[Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.002

廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2015617）；中醫藥強省建設專項資金第二批名中醫師承項目（粵中醫辦函[2015]93號）

楊璐齊（1992—），女（苗），在讀碩士，研究方向：營養與食品安全。

*通信作者：傅南琳（1964—），女，主任醫師，研究方向：中藥天然產物與健康關系的研究。