響應面法優化百合多糖超聲輔助提取工藝

張占軍，王富花，葛洪，張軍，李海鳳

（1.揚州市職業大學工程研究中心，江蘇揚州225009；2.揚州工業職業技術學院，江蘇揚州225127）

響應面法優化百合多糖超聲輔助提取工藝

張占軍1，王富花2，葛洪1，張軍1，李海鳳1

（1.揚州市職業大學工程研究中心，江蘇揚州225009；2.揚州工業職業技術學院，江蘇揚州225127）

以宜興百合為原料，采用超聲輔助法提取百合中的多糖物質。通過單因素試驗，考察不同水平的超聲功率、超聲溫度、超聲時間和液料比對百合多糖得率的影響，并在單因素試驗的基礎上采用響應面法優化超聲輔助提取百合多糖的工藝條件。試驗結果表明，百合多糖最佳提取工藝條件為：超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時間30 min和液料比15∶1（mL/g），在該條件下，百合多糖的平均得率為12.37%，與理論預測值間差異不顯著，表明試驗獲得的回歸數學模型能夠準確預測百合多糖的得率。

百合；多糖；響應面法；超聲；提取工藝

百合（Lily）為百合科百合屬多年生草本球根植物，又名強蜀、番韭、山丹、倒仙、重邁、中庭、摩羅、重箱、夜合花等，為衛計委首批公布的藥食兩用植物之一[1]。百合的藥用價值極高，其味甘微苦，性平，味淡，微寒，具有養陰潤肺止咳、清心安神、補中益氣的功效[2]。近年來的研究發現，百合中除含有氨基酸、蛋白質、淀粉、脂肪、維生素和微量元素等基本營養物質外，還含有多糖、秋水仙堿、皂苷等生物活性成分[3]。百合中多糖含量較高，最高可達30.41%[4]，其含量大小與品種、產地、采收期及提取檢測方法等因素密切相關。百合多糖具有廣泛藥理活性，如免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等生物活性，具有較高研究價值[5]。

目前多糖的提取多采用熱水浸提的方法，溫度高，耗時長。近年來超聲波輔助提取方法已廣泛應用于多糖的提取過程，利用超聲波的空化作用，可加速細胞壁的破裂，促進多糖的溶出，縮短提取時間，提高多糖提取效率。此外，響應面分析法作為一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法，已成功應用于多種多糖的提取過程。本試驗擬采用響應面優化法，以宜興百合的多糖得率為響應值，通過考察超聲功率、提取溫度、提取時間和液料比等因素，采用Box-Behnken中心設計法，建立并驗證相關的工藝數學模型，同時對提取的多糖進行初步分析，以期為藥食兩用植物百合的進一步開發利用提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合：產地江蘇宜興；無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、無水乙醚、丙酮等：國產分析純。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機：上海標本模型廠；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；R-210旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；TDL-5000B型離心機：上海安亭科學儀器廠；SB-5200DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；722可見分光光度計：上海光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助提取百合多糖工藝

新鮮百合→去雜、掰片、烘干→破碎→石油醚回流脫脂→95%乙醇回流除小分子→烘干（預處理樣品）→稱取適量→加水超聲輔助提取→離心→上清液濃縮→加乙醇至85%終濃度醇沉→離心→沉淀部分→依次用無水乙醇、丙酮、石油醚抽洗→干燥→百合粗多糖

1.3.2 多糖含量和提取率的測定

1.3.2.1 百合多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法。即利用硫酸對多糖的水解作用，生成的單糖脫水生成糠醛衍生物，后與苯酚反應生成有色化合物，在490 nm處進行比色測定[6]。

1.3.2.2 百合多糖得率的計算

百合多糖得率 Y/%=（WE× CT）/WP× 100

式中：WE為百合粗多糖的質量，g；WP為經預處理的百合質量，g；CT為百合粗多糖中總糖的含量。

1.3.3 單因素試驗

通過超聲輔助、熱水浸提、乙醇沉淀的方法提取百合多糖。分別考察不同水平的超聲功率、超聲溫度、超聲時間和液料比對百合多糖得率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗確定的各變量范圍，選取超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）和液料比（D）為自變量，百合多糖得率為響應值，通過Design Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken試驗設計方法，進行四因素三水平的響應面分析試驗，同時對試驗數據進行回歸分析，預測超聲輔助提取百合多糖的最佳提取工藝。

1.3.5 數據處理方法

所有數據均測定3次，以平均值±標準差方式表示，單因素試驗通過SPSS 22.0軟件進行數據處理進行差異顯著性分析，P＜0.05認為具有顯著差異，響應面試驗采用Design Expert 8.0.6軟件進行結果分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助提取單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對百合多糖得率的影響

超聲功率對百合多糖得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對百合多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the yield of Lily polysaccharide

由圖1可以看出，在100 W～160 W范圍內，百合多糖提取率隨著超聲功率提高而增加[7]，在超聲功率160 W時多糖得率達到最大值11.27%，此后再增大超聲功率，百合多糖得率開始下降。這可能是由于隨著超聲功率的增強，超聲波空化作用加劇，使得部分非多糖成分溶出，影響了百合多糖的溶出過程，同時超聲功率的增大也可能對溶出多糖產生一定程度的降解，因此導致百合多糖得率下降。綜合考慮，選擇160 W為百合多糖超聲功率中心試驗點。

2.1.2 超聲溫度對百合多糖得率的影響

超聲溫度對百合多糖得率的影響見圖2。

圖2表明，超聲過程中溫度對百合多糖提取得率有較為明顯的影響，在30℃～50℃范圍內，溫度升高，百合多糖得率增大，在超聲溫度為50℃時多糖得率達到最大值，此后再增大，百合多糖得率開始下降。溫度升高到一定值后，水分開始蒸發，影響多糖的溶出，同時溫度過高也導致了已溶出多糖的降解，從而造成百合多糖得率的降低[8]。因此選擇50℃為百合多糖超聲溫度中心試驗點。

圖2 超聲溫度對百合多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of Lily polysaccharide

2.1.3 超聲時間對百合多糖得率的影響

超聲時間對百合多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對百合多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the yield of Lily polysaccharide

從圖3可以看出，在超聲時間10 min～40 min范圍內，百合多糖提取率隨著超聲時間延長而增加，超聲時間至40 min時多糖得率達到最大值。此后再延長超聲時間，多糖得率變化不顯著，甚至有降低趨勢。這是由于開始提取液中百合多糖濃度低，延長時間有助于多糖的溶出，但當多糖的溶出達到一定程度后，單純延長時間很難再增加多糖的進一步溶解，甚至使多糖發生降解[9]。綜合考慮，選擇30 min為百合多糖提取超聲時間中心試驗點。

2.1.4 液料比對百合多糖得率的影響

液料比對百合多糖得率的影響見圖4。

圖4表明，在液料比5∶1 mL/g～20∶1 mL/g范圍內，百合多糖提取率隨著液料比增加而快速增加，液料比至20∶1 mL/g時多糖得率達到最大值，但當液料比15∶1 mL/g后再增加液料比，多糖得率增加不再顯著。這主要是由于初始溶劑越多，多糖溶出就越多，從而多糖得率增加，但當多糖溶解達到平衡時，再增加溶劑的量，多糖的溶解受到溶劑量的影響有限[10]。考慮到后期濃縮等操作，選擇15∶1 mL/g為百合多糖提取液料比中心試驗點。

圖4 液料比對百合多糖得率的影響Fig.4 Effects of ratio of water to material on the yield of Lily polysaccharide

2.2 響應面法對百合多糖提取條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert軟件進行四因素三水平的響應面法進行試驗設計，試驗方案及結果見表1。設計了29次響應面分析試驗，其中24次為析因點試驗，5次為零點試驗，以估計誤差。

表1 Box-Behnken設計模型及試驗值Table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

續表1 Box-Behnken設計模型及試驗值Continue table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

2.2.2 百合多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到百合多糖得率對以上4個因素的回歸方程為：

百合多糖得率=11.95+0.36A+0.41B+0.66C+0.44D+0.23AB+0.88AC-0.18AD-0.065BC+0.57BD-0.48CD-0.81A2-1.44B2-0.42C2-0.49D2

對回歸模型進行方差分析，結果見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

該模型的確定系數為R2=0.919 1，模型的調整確定系數為R2adj=0.838 2。同時從表2可以看出：模型F值為11.36，P＜0.000 1，表明模型是高度顯著的，模型的失擬項P=0.154 8，表明失擬不顯著，說明該模型較穩定，能較好地預測實際百合多糖提取情況。

2.2.3 響應曲面圖分析優化

因素交互作用對百合多糖得率影響的響應面圖見圖5。

圖5 超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）和液料比（D）等因素交互作用對百合多糖得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of ultrasonic power（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ratio of water to material（D）on the extraction yield of Lily polysaccharide

結合圖5可以看出，當超聲時間和液料比一定時，當超聲功率位于160 W～170 W，超聲溫度在50℃～55℃范圍內時，兩者交互作用對百合多糖得率的影響最大（圖5a）；當超聲溫度和液料比一定時，超聲功率越大，超聲時間越長，百合多糖提取率也越高，兩者交互作用對百合多糖得率影響極顯著，百合多糖得率的最大值位于超聲功率170 W～180 W，超聲時間35 min～40 min區域內（圖5b）；當超聲溫度和超聲時間一定時，超聲功率和液料比之間的交互作用對百合多糖得率的影響不顯著，百合多糖得率最大值區域位于兩者中心試驗點附近（圖5c）；當超聲功率和液料比一定時，百合多糖得率最大值區域位于超聲溫度50℃～55℃，超聲時間35 min～40 min范圍內，增加超聲時間對百合多糖得率的影響明顯大于超聲溫度的增加（圖5d）；當超聲功率和超聲時間一定時，超聲溫度和液料比之間的交互作用對百合多糖得率的影響顯著，隨著超聲溫度的升高、液料比的增大，百合多糖得率也隨之增大，最大值區域位于超聲溫度50℃～55℃，液料比17.5 mL/g～20 mL/g范圍內（圖5e）；當超聲功率和超聲溫度一定時，超聲時間和液料比之間的交互作用對百合多糖得率的影響不顯著，增加超聲時間對百合多糖得率的影響明顯大于液料比的改變（圖5f）。

2.2.4 提取參數優化及模型驗證

通過 Design Expert軟件可知，當 A＝0.80、B＝0.17、C＝1.00、D＝－0.08時，Y出現理論最大值12.70%。可得出百合多糖最佳提取工藝條件為超聲功率176 W，超聲溫度 51.7℃、超聲時間 30 min 和液料比 14.6∶1（mL/g）。考慮到實際操作的便利性，百合多糖最佳提取工藝條件最終確定為超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時間30 min和液料比15∶1（mL/g）。通過5次驗證性試驗，驗證了該模型方程的適用性，驗證性試驗中百合多糖的得率為（12.37±0.23）%，而回歸方程所得的理論預測值為12.71%，通過IBM SPSS Statistics 22軟件，進行單樣本T檢驗，表明P值=0.075＞0.05，因此可以認為采用優化工藝條件所得實驗值與理論預測值間沒有差異，即該方程能較好的預測百合多糖的提取得率。

3 結論

本研究以宜興百合為原料，通過單因素及響應面試驗，優化了超聲輔助提取百合多糖的工藝，基于Design Expert軟件得到百合多糖最佳提取工藝為：超聲功率176 W，超聲溫度52℃、超聲時間30 min和液料比15∶1mL/g。在此條件下，百合多糖的得率為12.37%，與傳統的熱水浸提法相比，該提取方法具有溫度低、時間短、提取效率高等優點，可為百合多糖的高效提取提供一定的參考。

[1] 劉木清,秦龍,伍春.百合繁殖技術[J].花木盆景:花卉園藝,2016(2):29-31

[2] 胥京宜.百合的開發與利用[J].湖北農業科學,1999(4):44

[3] You X,Xie C,Liu K,et al.Isolation of non-starch polysaccharides from bulb of tiger lily(Liliumlancifolium Thunb.)with fermentation of Saccharomyces cerevisiae[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(1):35-40

[4] 孫俊,張科衛,秦昆明,等.不同產地百合多糖的含量測定[J].南京中醫藥大學學報,2010,26(1):65-66

[5] Chen Z G,Zhang D N,Zhu Q,et al.Purification,preliminary characterization and in vitro immunomodulatory activity of tiger lily polysaccharide[J].Carbohydrate Polymers,2014,106(1):217-222

[6] 馮程程,王思明.桂花多糖的提取及含量測定方法研究[J].科技資訊,2013(3):87

[7] Zheng Y,Li Y,Wang W D.Optimization of ultrasonic-assisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Trametes orientalis[J].Carbohydrate Polymers,2014,111:315-323

[8] Liu Y,Qiang M,Sun Z,et al.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from Hovenia dulcis peduncles and their antioxidant potential[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,80:350-357

[9] Aun Raza,Feng Li,Xiuquan Xu,et al.Optimization of ultrasonicassisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapaquadrispinosa using response surface methodology[J].International Journal of Biological Macromolecules,2017,94:335-344

[10]Afshari K,Samavati V,Shahidi S A.Ultrasonic-assisted extraction and in-vitro antioxidant activity of polysaccharide from Hibiscus leaf[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,74:558-567

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Lily Polysaccharide by Response Surface Methodology

ZHANG Zhan-jun1，WANG Fu-hua2，GE Hong1，ZHANG Jun1，LI Hai-feng1
（1.Engineering Research Center，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

The polysaccharide from Lily was extracted by ultrasonic-assisted extraction （UAE）method using flesh Lily in Yixing as raw materials.Firstly，the effects of the four main factors（ ultrasonic power，ultrasonic temperature，ultrasonic time and ratio of water to material）on the yield of Lily polysaccharide was discussed through single-factor experiments.The extraction technological condition of Lily polysaccharide was optimized with response surface method after single－factor test.Results showed that the maximum extraction yield of Lily polysaccharide was obtained at ultrasonic power 176 W，extraction temperature 52℃，extraction time 30 min and ratio of water to material 15 ∶1（mL/g）.Under this condition，the yield of Lily polysaccharide with ultrasonic extraction was the best of 12.37%，and the difference was not significant compared with the theoretical prediction.The mathematical model obtained in this experiment could accurately predict the yield of polysaccharide from Lily.This results will provide an experimental basis to further develop the resources of Lily in Yixing.

Lily；polysaccharide；response surface methodology；ultrasonic；extraction process

2017-01-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.009

江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）項目（BK20141269）；江蘇省高校“青藍工程”中青年學術帶頭人資助[蘇教師[2016]15號]；江蘇省第五期“333高層次人才培養工程”

張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術。