響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙鶴草總黃酮提取工藝

葉春林，MUNYONHO Ferris Tatenda，黃盼盼，李嘉駿，經(jīng)潔，方慧

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，浙江杭州310023）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化仙鶴草總黃酮提取工藝

葉春林，MUNYONHO Ferris Tatenda，黃盼盼，李嘉駿，經(jīng)潔，方慧

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，浙江杭州310023）

為優(yōu)化仙鶴草中總黃酮的提取方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取時間、提取溫度、乙醇濃度和料液比為自變量，仙鶴草總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對總黃酮提取率的影響。采用Design-Expert軟件，建立總黃酮得率與因素間的二次回歸模型。結(jié)果表明：該回歸模型極顯著，預(yù)測性強(qiáng)。乙醇濃度和提取溫度是影響提取率的主要因素；優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件：提取時間100 min、提取溫度100℃、乙醇濃度30%、料液比1∶15（g/mL）。在此提取工藝條件下平行3次進(jìn)行驗(yàn)證，總黃酮得率為9.92%。

仙鶴草；響應(yīng)面法；黃酮；提取

仙鶴草（Herba Agrimoniae）為薔薇科龍芽草（Agrimonia pilosa Ledeb.）的干燥地上部分[1]，又稱金頂龍芽、龍芽草、脫力草、狼芽草等[2]。仙鶴草全草入藥，中醫(yī)臨床主要用于止血、降糖、抗腫瘤、泌尿道、呼吸道、消化道等疾病的治療[3]。仙鶴草主要含有鞣酸類、間苯三酚縮合體、黃酮類、有機(jī)酸、內(nèi)酯和香豆素類成分[4-5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，仙鶴草中含有蘆丁、芹菜素、山奈酚、木犀草素等多種黃酮類化合物[6]，黃酮類化合物是一類具有多樣生物活性的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于植物中[7]，具有降脂[8]、抗氧化[9]、降糖[10]等生物活性，日益成為醫(yī)藥工作者的研究熱點(diǎn)。

本研究以仙鶴草總黃酮提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面統(tǒng)計(jì)法優(yōu)化其提取工藝，為仙鶴草的深加工及提高附加值提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

仙鶴草：杭州市西湖區(qū)藥房，粉碎過60目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（光譜純）、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

BS2202S精密天平：SARTORIUS公司；752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮含量的測定

[11]，求得總黃酮質(zhì)量濃度（y，mg/mL）與吸光度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.085 3x-0.000 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出總黃酮類物質(zhì)質(zhì)量濃度。

按回歸方程計(jì)算，按下式計(jì)算總黃酮的提取率：

式中：C為仙鶴草提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為提取用仙鶴草的質(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 提取時間考察

精確稱取5份5 g仙鶴草粉于三口燒瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇各50 mL，在60℃恒溫水浴鍋中分別冷凝回流提取 30、60、90、120、150 min，趁熱過濾，冷卻后分別取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度計(jì)下測定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。比較不同提取時間的仙鶴草黃酮提取率，以確定提取時間較優(yōu)取值。

1.2.2.2 提取溫度考察

精確稱取5份5 g仙鶴草粉于三口燒瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，分別在60、70、80、90、100℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 mim，趁熱過濾，冷卻后分別取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度計(jì)下測定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。比較不同提取溫度下，仙鶴草黃酮的提取率，確定提取溫度較優(yōu)取值。

1.2.2.3 乙醇濃度考察

精確稱取5份5 g仙鶴草粉于三口燒瓶中，分別加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液，在60℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 min，趁熱過濾，冷卻后分別取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度計(jì)下測定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。比較不同乙醇濃度的仙鶴草黃酮提取率，確定乙醇濃度較優(yōu)取值。

1.2.2.4 料液比考察

精確稱取5份5 g仙鶴草粉于三口燒瓶中，分別加入 60%的乙醇溶液各 50、75、100、125、150 mL，在60℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 min，趁熱過濾，冷卻后分別取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度計(jì)下測定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。比較各料液比下仙鶴草黃酮提取率，以確定料液比較優(yōu)取值。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對仙鶴草總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過擬合二次多項(xiàng)式方程，計(jì)算出最佳工藝組合及在此條件下的總黃酮的最大提取率理論值。

應(yīng)用Design-Expert 8.05b軟件采用Central Composite Design（CCD）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以仙鶴草總黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。響應(yīng)曲面因素與水平的確定見表1。

表1 響應(yīng)曲面因素與水平表Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.4 驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

通過軟件分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取測定，比較試驗(yàn)結(jié)果和方程計(jì)算值的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時間對仙鶴草黃酮提取率的影響

提取時間對仙鶴草黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of the extraction time on the yield of total flavonoids

由圖1可見，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率增大，當(dāng)提取時間到達(dá)60 min時，總黃酮提取率達(dá)到最大，再繼續(xù)增加時間，總黃酮提取率反而下降。其原因可能是提取時間太短，黃酮與蛋白質(zhì)、多糖等結(jié)合物不能較好地分離，提取率較低；提取時間過長，部分黃酮結(jié)構(gòu)受到破環(huán)，從而降低了提取率。故提取時間選擇60 min為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.1.2 提取溫度對仙鶴草黃酮提取率的影響

提取溫度對仙鶴草黃酮提取率的影響見圖2所示。

圖2 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on the yield of total flavonoids

由圖2可見，黃酮提取率隨提取溫度的升高而變化顯著，變化趨勢為先增大后減小，當(dāng)溫度在80℃時提取率最大。這可能是起始升高溫度有利于總黃酮的擴(kuò)散、溶出，故提取率增大，而當(dāng)溫度過高時，黃酮會受熱分解，或雜質(zhì)溶解度增大等原因，以致提取率減小。故提取溫度選擇80℃為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.1.3 乙醇濃度對仙鶴草黃酮提取率的影響

提取溶劑中乙醇濃度對仙鶴草總黃酮得率的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，乙醇濃度為10%～20%時，總黃酮的得率逐漸升高；當(dāng)乙醇濃度為20%～50%時，總黃酮的得率有明顯的下降，可能的原因是隨乙醇濃度的升高，溶液極性減弱，可溶性黃酮成分含量減少所致。故乙醇濃度選擇20%為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

圖3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of the concentration of ethanol on the yield of total flavonoids

2.1.4 料液比對仙鶴草黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to solvent on the yield of total flavonoids

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，仙鶴草的黃酮提取量隨料液比的增大而增大，但料液比增大到一定程度后，黃酮提取量逐漸趨于飽和。仙鶴草在料液比為1∶25（g/mL）時總黃酮提取量達(dá)到最大，故料液比選擇1∶25（g/mL）為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The central composite design and the results of experiments

續(xù)表2 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Continue table 2 The central composite design and the results of experiments

利用Design-Expert 8.0.5b軟件，根據(jù)表1設(shè)定的因素和水平，選取 A（提取時間）、B（提取溫度）、C（乙醇濃度）、D（料液比）4因素為自變量，黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)及其結(jié)果見表2。對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和方差分析，得回歸方程：Y=3.79+0.36A+0.50B+0.55C+0.033D+0.18AB+0.11AC-0.22AD+0.27BC+0.079BD-0.14CD-0.057A2+0.12B2+0.036C2-0.051D2，其中 Y 為仙鶴草黃酮提取率，A、B、C、D 分別為上述3個自變量的編碼值。方差分析見表3。

由表3可得，該回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），具極度顯著性，能夠正確反映各因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。確定系數(shù)R2=0.973 2，表明可用該模型解釋97.32%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；調(diào)整的確定系數(shù)Radj2=0.948 1，說明該模型反映的仙鶴草黃酮提取率的變化有94.81%來自A、B、C、D 4個因素；模型的變異系數(shù)CV=5.02%，較小，說明試驗(yàn)穩(wěn)定、可靠。

表3 仙鶴草黃酮提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Agrimonia pilosa

從表3顯著性水平P可見，模型中各因素對Y值影響極顯著的為A、B、C、AD、BC，高度顯著的為AB、B2，顯著的為 AC、CD，而 D、BD、A2、C2、D2為不顯著。這反映了提取溫度、提取時間、乙醇濃度及料液比4因素對仙鶴草黃酮提取率的顯著影響既有線性關(guān)系也有平方關(guān)系，也存在極顯著的交互作用。從F值大小可知，4因素對仙鶴草黃酮提取率影響大小次序?yàn)椋阂掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r間＞料液比。

2.2.2 試驗(yàn)因素交互作用對響應(yīng)值影響的3D分析

對二次歸模型中提取時間、提取溫度、乙醇濃度和料液比4因素，分別固定2因素（取0水平值）而改變其余2因素取值，根據(jù)所得響應(yīng)值，可繪出響應(yīng)曲面圖。因素交互作用對仙鶴草黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖如圖5所示。

由圖5可知，并不是所有因素對仙鶴草總黃酮的提取都有顯著的影響。其中，乙醇濃度和提取溫度的影響最為顯著，隨著乙醇濃度和提取溫度的增大，總黃酮得率隨之增大，表現(xiàn)為曲面較陡；提取時間的影響次之，表現(xiàn)為曲面相對平緩且隨其數(shù)值的增加而增大，響應(yīng)值變化相對較小；料液比的影響最小，曲面最為平緩。顯然，響應(yīng)面圖分析結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證

利用Design Expert 8.0.5b軟件分析得到回歸模型，得到最佳提取工藝為：提取時間100 min、提取溫度100℃、乙醇濃度 30%、料液比 1∶15.35（g/mL），此條件下仙鶴草總黃酮提取率預(yù)測值為10.05%。

圖5 各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the effect of the interaction between the two test variables and the yield of total flavonoids

為檢驗(yàn)上述理論工藝條件的可靠性，須做驗(yàn)證試驗(yàn)。為試驗(yàn)操作和控制方便，可將理論工藝條件修改為：提取時間100 min、提取溫度100℃、乙醇濃度30%、料液比 1∶15（g/mL）。在此條件下，進(jìn)行平行 3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總黃酮平均得率實(shí)際值為9.92%，與理論預(yù)測值10.05%相比，相對誤差為1.29%，二值非常接近，說明該回歸模型能較好地模擬和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面優(yōu)化法所確定的仙鶴草總黃酮提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

對仙鶴草總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得到多因素二次回歸方程，方差分析顯示該回歸方程具有高度顯著性，擬合度良好，能夠較好地對仙鶴草總黃酮提取工藝進(jìn)行預(yù)測分析。響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳提取工藝為提取時間100 min、提取溫度100℃、乙醇濃度30%、料液比1∶15（g/mL）。平行3次驗(yàn)證結(jié)果顯示，實(shí)測值與預(yù)測值吻合度較好，模型可靠性較高，能進(jìn)行較好的結(jié)果預(yù)測。

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Optimization of Extraction of the Total Flavonoids from Agrimonia pilosa Ledeb.by Response Surface Methodology

YE Chun-lin，MUNYONHO Ferris Tatenad，HUANG Pan-pan，LI Jia-jun，JING Jie，F(xiàn)ANG Hui
（School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

In order to optimize the extraction method of total flavonoids from Agrimonia pilosa Ledeb.，based on single factor experiments，extraction time，extraction temperature，ethanol concentration and ratio of solid to liquid were selected as influencing factors and the yield of total flavonoids as response during extraction.The experiment method was designed according to central composite design and each variable and their interactions effects on the yield of total flavonoids were studied.The quadratic multinomial model on the yield of total flavonoids and each factor was established by using the Design-Expert software.The results showed that the regression model was very significant and the forecast was strong.Ethanol concentration and extraction temperature were the main factors.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction time of 100 min，extraction temperature of 100℃，ethanol concentration of 30%and ratio of solid to liquid 1∶15（g/mL）.The verification experiment，repeated three times in the best extraction conditions，showed that the average yield of flavonoids was 9.92%.

Agrimonia pilosa Ledeb.；response surface methodology；flavonoids；extraction

2017-01-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.011

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃（2016R415018）

葉春林（1969—），男（漢），副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物的提取工藝及其生物活性的研究。