蒽酮-硫酸法測定榛花多糖含量條件的優(yōu)化

申希峰，黃杰濤，張蓮姬

（延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133000）

蒽酮-硫酸法測定榛花多糖含量條件的優(yōu)化

申希峰，黃杰濤，張蓮姬*

（延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133000）

探討蒽酮-硫酸法測定多糖含量的影響因素，并優(yōu)化榛花多糖含量測定的最佳條件。試驗(yàn)以吸光度值為評價(jià)指標(biāo)，檢測波長為625 nm，對蒽酮質(zhì)量濃度、加熱溫度、蒽酮試劑用量和加熱時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選測定條件。結(jié)果表明，1 mL樣液下，蒽酮質(zhì)量濃度20 mg/mL、加熱溫度90℃、蒽酮試劑用量4.0 mL、加熱時(shí)間10 min的條件最優(yōu)。最佳工藝下，平均回收率為99.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%。

榛花；多糖；蒽酮-硫酸法；條件優(yōu)化

榛花為樺木科（Butelaceae）植物榛Corylus heterophyllaFisch.ex Bess的雄花[1]，主要分布在東北、華北、西北、華東以及西南地區(qū)[2]。棒花具有消炎、消腫、止痛作用，可用于皮膚炎癥、凍傷等[3]。多糖具有多種生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗輻射[8]、抗菌抗病毒[9]等。目前已經(jīng)有榛花抗菌活性[10]與降血糖[11]作用的研究報(bào)道，但關(guān)于榛花多糖的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

目前，多糖的測定方法有多種方法，如苯酚-硫酸法[12]、酶法[13]、高效液相色譜法[14]和蒽酮-硫酸法等。酶法與高效液相色譜法需要多糖標(biāo)準(zhǔn)樣品、特定的酶以及較昂貴的儀器，在應(yīng)用中受到限制[15]，對于有色樣品中多糖的測定，苯酚-硫酸法較于蒽酮硫酸法所受到的影響更大[16]。蒽酮-硫酸法快速且無需精密儀器，對有色樣品中多糖測定影響較小，應(yīng)用比較廣泛。蒽酮-硫酸法的測定原理是多糖在濃硫酸的作用下水解為單糖，并迅速脫水生產(chǎn)糠醛衍生物，其與蒽酮結(jié)合生成有色化合物。因?yàn)椴煌暮俏镔|(zhì)測定條件均有所不用等特點(diǎn)，導(dǎo)致蒽酮－硫酸法存在一定波動(dòng)性[17]，如果只考慮一般文獻(xiàn)的測定條件，可能會(huì)造成較大的誤差。因此為提高榛花多糖含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文應(yīng)用蒽酮—硫酸法建立榛花多糖含量的測定方法，并分別觀察蒽酮質(zhì)量濃度、加熱溫度、蒽酮試劑用量與加熱時(shí)間對榛花多糖水解的影響，再通過正交法優(yōu)選其最佳測定條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

榛花：采集于吉林省長白山，曬干后粉碎，過60目篩。

蒽酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸：天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚：遼寧泉瑞試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2臺(tái)式離心機(jī)：金壇市科析儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP114電子天平：奧豪斯儀器；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青埔滬西儀器廠；DGF-4A型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 榛花粗多糖樣品液的配制

干燥的榛花粉采用索氏提取器，分別以無水乙醚和無水乙醇處理至回流液的顏色接近無色。準(zhǔn)確稱取已處理的1.000 g榛花粉，加入30 mL的蒸餾水，80℃水浴提取 2 h，離心（3 500 r/min）20 min，上清液濃縮后加入4倍體積的無水乙醇放置過夜，沉淀冷凍干燥得到粗多糖，并加水定容到1 000 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

方法參見文獻(xiàn)[18-19]。

1.2.3 多糖含量的計(jì)算

取1.2.1方法得到的多糖樣品溶液1 mL，加入到10 mL比色管中，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)與體積的蒽酮試劑，在一定的溫度下，加熱一定的時(shí)間后用冰水冷卻10 min，在625 nm處測定其吸光度值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中多糖的含量[20]。多糖含量：

式中：C為測得的樣品溶液中葡萄糖濃度，%；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；f為換算因子1.274；W為榛花干粉質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗(yàn)

依次進(jìn)行榛花多糖蒽酮質(zhì)量濃度、加熱溫度、蒽酮試劑用量與加熱時(shí)間的單因素試驗(yàn)，每個(gè)單因素試驗(yàn)所得到的最優(yōu)值為下一組單因素試驗(yàn)的固定條件。

第一組的固定因素是加熱溫度100℃，蒽酮試劑用量4.0 mL，加熱時(shí)間15 min，這時(shí)的單因素變量是蒽酮質(zhì)量濃度，5 組為 10、15、20、25、30 mg/mL。

第二組的固定因素是質(zhì)量濃度20 mg/mL，蒽酮試劑用量4.0 mL，加熱時(shí)間15 min，這時(shí)的單因素變量是加熱溫度，5 組為 60、70、80、90、100 ℃。

第三組的固定因素是質(zhì)量濃度20 mg/mL，加熱溫度100℃，加熱時(shí)間15 min，這時(shí)的單因素變量是蒽酮試劑用量，5 組為 2、4、6、8、10 mL。

最后一組的固定因素是質(zhì)量濃度20 mg/mL，加熱溫度100℃，蒽酮試劑用量4.0 mL。這時(shí)的單因素變量是加熱時(shí)間，5 組為 5、10、15、20、25 min。

1.4 測定條件因子水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖含量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，得出最佳測定條件。試驗(yàn)按L9（34）正交表設(shè)計(jì)，見表1。

表1 因素水平表Table 1 Orthogonal design table

1.5 精密度試驗(yàn)[21]

吸取榛花多糖樣品液1.0 mL，由1.4確定的最佳測定條件下平行5次測定，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，并分析其重現(xiàn)性。

1.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)[22]

分別吸取榛花多糖樣品液1.0 mL 3份于50 mL錐形瓶中，按1.4確定的最佳測定條件下測定吸光度。另取3份榛花多糖溶液1.0 mL于50 mL錐形瓶中，分別加入1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液由1.4確定的最佳測定條件下測定吸光度，按下式計(jì)算加標(biāo)回收率。

回收率/%=（加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值）/加標(biāo)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 蒽酮質(zhì)量濃度對多糖吸光度的影響

蒽酮質(zhì)量濃度對多糖吸光度的影響見圖1。

圖1 蒽酮質(zhì)量濃度對多糖吸光度的影響Fig.1 Effect of anthrone concentration on the absorbance of polysaccharides

由圖1可知，當(dāng)蒽酮試劑質(zhì)量濃度在10 mg/mL～20 mg/mL之間，吸光度隨蒽酮試劑質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度大于20 mg/mL后，其吸光度開始下降。因此，確定蒽酮試劑質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.1.2 加熱溫度對多糖吸光度的影響

加熱溫度對多糖吸光度的影響見圖2。

圖2 加熱溫度對多糖吸光度的影響Fig.2 Effect of heating temperature on the absorbance of polysaccharides

由圖2可知，隨著加熱溫度的提高，多糖的吸光度也隨著增加，在90℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著加熱溫度的繼續(xù)提高，吸光度開始下降，因此確定最優(yōu)的加熱溫度為90℃。

2.1.3 蒽酮試劑用量對多糖吸光度的影響

蒽酮試劑用量對多糖吸光度的影響見圖3。

圖3 蒽酮試劑用量對多糖吸光度的影響Fig.3 Effect of anthrone reagent on polysaccharide absorbance

蒽酮試劑使用量不同，對榛花多糖的顯色效果也不同，用量在2.0 mL～4.0 mL時(shí)，隨著用量的增加，吸光度開始增加，當(dāng)蒽酮試劑用量為4.0 mL時(shí)，樣品吸光度達(dá)到最大。隨后再增加蒽酮試劑的用量，吸光度開始下降。因此，確定蒽酮試劑最佳用量為4.0 mL。

2.1.4 加熱時(shí)間對多糖吸光度的影響

加熱時(shí)間對多糖吸光度的影響見圖4。

圖4 加熱時(shí)間對多糖吸光度的影響Fig.4 Effect of heating time on the absorbance of polysaccharides

由圖4可知，隨著加熱時(shí)間的增加，吸光度先增加后減少，其原因是濃硫酸多糖的水解作用，需要一定時(shí)間后才能反應(yīng)完全，因此吸光度會(huì)先增加。同時(shí)又因?yàn)闈饬蛩岬膹?qiáng)氧化作用，破環(huán)了反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，造成吸光度減小。所以最佳加熱時(shí)間為10 min[23]。

2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化蒽酮-硫酸法測定多糖條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L3（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results and analysis of orthogonal test

從表2L9（34）正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可以推斷出，蒽酮試劑用量對吸光度的影響最大，是影響測定多糖含量的最主要因素；也可以在表格里得到這樣的信息：蒽酮試劑用量影響程度最高，其次是蒽酮質(zhì)量濃度，然后是加熱時(shí)間，最后是加熱溫度；且測定榛花多糖含量的最好的因素組成是A2B2C2D2，而試驗(yàn)測定結(jié)果中，吸光度最大的組合為A1B2C2D2，因此對這兩組進(jìn)行了比較，其結(jié)果見表3。

由表3可知，A2B2C2D2組合優(yōu)于A1B2C2D2，所以最佳測定條件是A2B2C2D2，蒽酮質(zhì)量濃度為20 mg/mL，加熱溫度為90℃，蒽酮試劑用量為4.0 mL，加熱時(shí)間為10 min。

表3 試驗(yàn)組的吸光度比較結(jié)果Table 3 The result of samplesp absorbance

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線見圖5。

圖5 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Glucose standard curve

圖5可以看出，其回歸曲線為y=0.010 5x-0.062 2，相關(guān)系數(shù)r值為0.997 4，可得葡萄糖濃度在20 μg/mL～100 μg/mL的質(zhì)量范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密度測定結(jié)果分析見表4。

表4 精密度測定結(jié)果分析Table 4 Precision measurement result analysis

由表4可知，榛花多糖溶液重復(fù)測定5次試驗(yàn)的RSD（n=5）值為1.17%，可知精密度良好。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Recovery experimental results

由表5可得，該試驗(yàn)方法的平均回收率為99.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.58%，說明該方法是準(zhǔn)確可靠的。

2.6 榛花多糖含量測定

按1.2.3方法計(jì)算多糖含量，代入2.4里5次試驗(yàn)的平均吸光度值0.537，從而計(jì)算得到榛花多糖中總糖含量為5.71%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)先通過在單因素的基礎(chǔ)上，再采用正交法對蒽酮—硫酸法對榛花多糖的測定條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果的最佳顯色條件是：1 mL樣液下，蒽酮質(zhì)量濃度20 mg/mL、加熱溫度90℃、蒽酮試劑用量4.0 mL、加熱時(shí)間10 min的條件最優(yōu)，其加標(biāo)回收率為99.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%，測定樣品中的多糖含量為5.71%。該方法的穩(wěn)定性與重復(fù)性好，簡單快速，適用于榛花中多糖的測定，為榛花多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Determination of Optimal Conditions of Polysaccharide Content of Hazel's Flower by Anthrone Sulfuric Acid Method

SHEN Xi-feng，HUANG JIE-tao，ZHANG Lian-ji*
（College of Science，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

To optimize the content determination conditions ofCorylus hecerophyllapolysaccharide by anthrone-sulfuric acid method.Anthrone-sulfuric acid method was used for content determination glucose as parameters.The absorbance was measured at 625 nm.A single factor test was performed on the concentration，heating temperature，anthrone reagent dosage and heating time.L9（34）orthogonal design was chosen for optimum measuring conditions.The results showed that 10 min reaction at 90℃in the presence of 4.0 mL of 20 mg/mL anthrone reagent was found to be optimal in 1mL sample fluid.The average recovery was up to 99.63%，and the RSD was 1.58%.

Hazel's flower；polysaccharide；anthrone-sulfuric acid method ；process optimization

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.030

延邊大學(xué)2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（ydbksky2016102）

申希峰（1995—），男（朝鮮），在讀本科，研究方向:天然產(chǎn)物的提取及活性。

*通信作者：張蓮姬（1970—），女，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的提取及活性。