氣相色譜-質譜法分析啤酒中游離脂肪酸

周漪波，朱志鑫，梁永威，黃瀠惠

（中國廣州分析測試中心廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東廣州510070）

氣相色譜-質譜法分析啤酒中游離脂肪酸

周漪波，朱志鑫*，梁永威，黃瀠惠

（中國廣州分析測試中心廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東廣州510070）

啤酒中游離脂肪酸的含量對啤酒的風味具有重要的影響。采用固相萃取法對市售啤酒中游離脂肪酸成分進行提取，氣相色譜/質譜法進行定性分析并外標法定量。通過添加一定加標水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸），結果表明各脂肪酸在不同的加標濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標準偏差為2.2%～3.8%，試驗精密度較高。比較不同比例提取溶劑對各種脂肪酸回收率的研究，結果表明采用正己烷-乙醚（體積比50∶50）作為提取溶劑時提取效率相對最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕櫚酸89.8%、油酸93.5%），說明該方法能準確測定啤酒中的游離脂肪酸含量。

氣相色譜/質譜（GC-MS）；回收率；啤酒；游離脂肪酸

啤酒是以麥芽為主要原料，添加酒花、酵母發酵釀制而成的一種含二氧化碳、低酒精度的飲料酒[1]。啤酒中存在的揮發性、低揮發性及不揮發性有機酸超過100多種，其中游離脂肪酸在多個方面影響啤酒質量[2-4]。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等形成辛基風味，其中辛酸和癸酸是“酵母味”的代表物質[5]，長鏈不飽和脂肪酸會使麥汁渾濁，其通過氧化作用形成的氫過氧化物在一定條件下降解產生醛類等老化物質，尤其是亞油酸和亞麻酸是反-2-壬烯醛的前體物質[6]。另外，游離脂肪酸還影響啤酒的泡沫穩定性及泡沫掛杯性等[7]，啤酒中的長鏈脂肪酸含量一般都比較低，而當啤酒儲藏在極惡劣的條件時，其含量就容易增加很多，導致啤酒口味變差[8]。再者由于飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例同泡沫相關[9-10]，而啤酒泡沫是其重要的外觀特性。

為了研究游離脂肪酸對啤酒品質的影響,應該建立一套行之有效的測定方法。游離脂肪酸在啤酒中的含量極少,性質又極不穩定,如何對樣品進行前處理是測定的關鍵。水蒸汽蒸餾[11-12]原理簡單但提取過程時間長、溫度高、其過程易造成成分的揮發損失，溶劑液液萃取法[13-15]儀器設備簡單、操作方便，但由于啤酒樣品相對基質復雜，含有碳水化合物、氨基酸、蛋白質、維生素、礦物質和少量脂肪酸[16]，萃取過程中容易產生乳化現象，導致萃取物損失[17]。最近幾年，頂空頂相色譜法[18]、固相微萃取法[19]等也用于啤酒中脂肪酸的提取，但這兩種方法僅適合中短鏈脂肪酸的提取，對長鏈脂肪酸的萃取效率相對較低。

固相萃取是近年發展起來一種樣品預處理技術，可以更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力，并已經在脂肪酸分析中發揮作用[20]。本文采用固相萃取法對啤酒樣品進行處理，氣相色譜-質譜法檢測，根據質譜特征離子結合色譜保留時間確定游離脂肪酸的組成可以消除啤酒中復雜基體的干擾。結果表明該方法具有較高的準確率和回收率，結果準確可靠，適合啤酒樣品中的游離脂肪酸分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HP 6890GC/5973MSD氣相色譜/質譜聯用儀：美國安捷倫公司；旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；脂肪酸甲酯對照品（1 mL，37 個組分，C4～C24 200 μg/mL～400 μg/mL）：美國 Supelco公司；辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸：美國Sigma公司。

Chem Elut SLE硅藻土液/液萃取柱：美國安捷倫公司；三氟化硼-甲醇溶液：上海安譜科學儀器有限公司；正己烷、乙醚（分析純）：廣州化學試劑廠。

試驗用水為GB/T6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水。

啤酒樣品：廣州某大型超市。

1.2 標準溶液的配制

取脂肪酸甲酯對照品于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到濃度為 20 μg/mL～60 μg/mL 的標準儲備溶液；取1 mL標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到濃度為2.0 μg/mL～6.0 μg/mL的標準溶液。

分別準確稱20.0 mg辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸于50 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容，得到濃度為400 μg/mL的標準溶液。

1.3 樣品預處理

取20mL啤酒樣品，超聲振蕩除氣。讓啤酒樣品緩慢通過固相萃取小柱，然后用20mL正己烷-乙醚（體積比50∶50）將脂肪酸洗脫出來，濾入100 mL梨形瓶中，旋轉蒸發器將其濃縮至1mL，轉入10mL酯化管中。

1.4 酯化方法

在酯化管中加入0.1 mL 14%的三氟化硼-甲醇溶液，在95℃酯化20 min，再加入2 mL水及2 mL正己烷，振蕩分層,收集有機相，用真空旋轉蒸發器濃縮至1.0 mL，待測定。在這種酯化條件下，只有游離的脂肪酸能夠被甲酯化，而以甘油三酯和磷脂形式存在的脂肪酸不會被酯化[5]。

1.5 色譜條件及質譜參數

1.5.1 色譜條件

色譜柱 DB-FFAP（30 m×0.32 mm×0.50 μm）；柱溫80℃，程序升溫8℃/min，至220℃下保持10 min；進樣口溫度240℃；載氣He，柱流量0.8 mL/min；進樣模式：不分流進樣。

1.5.2 質譜參數

EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍29 u～400 u，四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，電子倍增器電壓1 500 V，GC/MS接口溫度280℃，檢索譜庫為Nist11.L。

2 結果與討論

2.1 樣品的定性檢測

分別將脂肪酸甲酯標準溶液和經處理的啤酒樣品0.2 μL注入到氣相色譜/質譜聯用儀，根據質譜特征離子[21]及標準品色譜保留時間得到的總離子流圖進行定性分析。啤酒樣品1的總離子流圖見圖1。

2.2 樣品的定量檢測

分別將定性出來的脂肪酸甲酯的峰面積與標樣的峰面積比較，單點法定量，其結果見表1。

2.3 結果與分析

由于啤酒的基質比較復雜，方法的準確性可以通過考察回收率和精密度等來完成。

圖1 啤酒樣品1的總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the beer sample 1

表1 不同啤酒樣品游離脂肪酸含量Table 1 The content of free fatty acids in beer samples

2.3.1 方法的回收率和精密度

為了評價方法的準確性，首先測試啤酒樣品中天然存在的各種脂肪酸的濃度，然后添加一定加標水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕櫚酸、油酸），按試驗方法處理后進行測試，然后測試加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸濃度，進而得到其回收率，同時進行6個平行樣品測試，計算該方法的相對標準偏差（RSD），結果見表2。

從表2可以看出，各脂肪酸在不同的加標濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標準偏差為2.2%～3.8%，試驗精密度較高，說明該方法能準確測定啤酒中的游離脂肪酸含量。

表2 回收率和精密度試驗結果Table 2 Recovery and precision

2.3.2 提取溶劑的選擇

中鏈飽和脂肪酸（如辛酸和月桂酸）中極性基團部分相對較小，非極性脂肪鏈部分使之更像非極性化合物，因此，非極性溶劑正己烷也非常適合提取飽和中鏈和斷鏈脂肪酸，需要通過使用不同比例的正己烷-乙醚來確定最佳提取溶劑。

首先測試啤酒樣品中天然存在的各種脂肪酸的濃度，然后添加一定數量的各種脂肪酸（2.0 mg），選擇不同溶劑按試驗方法提取后進行測試，得到加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸濃度，進而得到其回收率，結果見圖2。

圖2 不同溶劑各種脂肪酸回收率Fig.2 Recovery of fatty acids using different solvents

由圖2可以看出，采用正己烷-乙醚（50∶50，體積比）作為提取溶劑時各種脂肪酸的回收率最高（辛酸82.1%，癸酸84.2%，月桂酸88.4%，棕櫚酸89.8%，油酸93.5%）。其中中短鏈脂肪酸的回收率偏低，特別是辛酸，這可能由于辛酸的碳數相對比較少，相對極性偏大，使辛酸更容易留在水相而不容易被萃取出來。

3 結論

本文提出用固相萃取法提取、氣相色譜/質譜法進行定性分析并外標法定量檢測啤酒中脂肪酸含量的方法，可以克服啤酒中游離脂肪酸含量極少，采取常規的提取方法難以滿足檢測要求的問題。通過對方法回收率和精密度的考察，結果表明各脂肪酸在不同的加標濃度下都能獲得較高的回收率（78.1%～93.5%），標準偏差為2.2%～3.8%，試驗精密度較高。比較不同比例提取溶劑對各種脂肪酸回收率的研究，發現采用正己烷-乙醚（體積比50∶50）作為提取溶劑時提取效率相對最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕櫚酸89.8%、油酸93.5%），說明該方法能準確測定啤酒中的游離脂肪酸含量。該方法具有萃取時間短，減少了有毒溶劑的使用，且萃取結果不受乳化效果的影響等優點，并提供了自動化的可能性，是啤酒中游離脂肪酸分析的理想方法。

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Determination of Free Fatty Acids in Beer by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHOU Yi-bo，ZHU Zhi-xin*，LIANG Yong-wei，HUANG Ying-Hui
（Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology，China National Analytical Center（Guangzhou），Guangzhou 510070，Guangdong，China）

The content of free fatty acids in beer has important influence to its flavor.The free fatty acids in beer sample were extracted using solid phase extraction method，and then they were esterified and analyzed by GCMS.The recovery was conducted by adding a certain amount of fatty acid（caprylic acid，capric acid，lauric acid，palmic acid and oleic acid），and the result illustrated that relative high recovery can be obtained（78.1%-93.5%）with the relative sandard deviation（RSD）were 2.2%-3.8%.The results showed that the extraction efficiency was the highest when n-hexane-ethyl ether（50 ∶50 Volume ratio）was selected as the extractive solvent.This method has the advantage of fast operation，reliable，low solvent consumption and high recovery，and it can meet the requirements of the analysis of free fatty acids in beer.

gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；recovery；beer；free fatty acids

2017-05-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.031

周漪波（1981—），男（漢），助理研究員，碩士，主要從事食品質量與安全方面的研究。

*通信作者：朱志鑫（1977—），男，高級工程師，碩士，主要從事食品質量與安全方面的研究。