超高效液相色譜法測定飲料中6種合成色素

方曉麗

（平陽縣疾病預防控制中心，浙江平陽325400）

超高效液相色譜法測定飲料中6種合成色素

方曉麗

（平陽縣疾病預防控制中心，浙江平陽325400）

建立超高效液相色譜同時測定飲料中6種人工合成色素（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍）的方法。飲料用聚酰胺粉吸附色素，除去雜質后用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）洗脫色素，以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨為流動相，梯度洗脫，在ACQUITY UPLCRBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱上分離，在254 nm波長處檢測。6種色素分離效果良好，線性范圍寬，相關系數r≥0.999 5，實際樣品加標回收率為82.2%～104.5%，相對標準偏差為0.04%～4.6%。

超高效液相色譜；合成色素；飲料

飲料是日常生活中的常見飲品，市場上色彩斑斕的飲料數量眾多，但這些外觀絢麗的飲料大部分人為添加了各種色素，其中尤以人工合成色素為多。人工合成色素大多為含有苯環或氧雜蒽結構的有機化合物，結構上分為：偶氮色素，如檸檬黃、誘惑紅等；三苯甲烷系色素，如亮藍等；氧雜蒽色素，如赤蘚紅等。研究表明，人工合成色素過量食用對人體有害，甚至對兒童智力產生不利影響，部分偶氮類的合成色素已被證明有致癌作用，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]也明確規定了飲料中各種人工合成色素允許的最大允許添加量，但由于與天然色素相比，人工合成色素因價格便宜、色澤鮮艷、色調多樣、性質穩定而被生產廠家更廣泛使用并時有過量添加的現象曝光，所以建立人工合成色素的快速有效檢測方法對市場飲料安全及消費者權益維護均有重要意義。

大多數文獻報道采用液相色譜法[2-4]檢測人工合成色素。國標GB/T 5009.35-2003《食品中合成色素的測定》[5]第一法是高效液相色譜法，但沒有給出同時檢測含誘惑紅在內的多種合成色素的方法。最新公布的標準GB/T 5009.141-2003《食品中誘惑紅的測定》[6]規定誘惑紅的檢測方法為紙色譜法，此方法操作麻煩，檢出限高（取樣量10 g，檢出限為25 mg/kg），已經超出了某些食品的最大允許添加量（如肉灌腸類為15 mg/kg），無法滿足日常檢測工作的需要。普通液相色譜法在多目標物檢測時，往往存在分離困難、分析時間長、試劑消耗量大等問題，且國標采用同一波長（254 nm）檢測不同色素，特異性不強，容易出現假陽性結果。本文建立的超高效液相色譜法采用二極管陣列檢測器，可掃描分離物全波段的紫外吸收光譜，顯著降低假陽性結果出現的概率，且與普通液相色譜相比，超高效液相色譜采用了小顆粒雜化填料（1.7 μm），極大地提高了分離度，從而有效提高了分析速度和靈敏度，適用于飲料中多種人工合成色素同時檢測，對其他類食品中合成色素的檢測也有參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-CLASS超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器：美國WATERS公司；SQP萬分之一天平：賽利多斯公司；5430R高速冷凍離心機：CEN TRIFU公司；Milli-Q Direce純水處理器：德國默克密理博公司。

1.2 試劑

甲醇（色譜純）：默克股份有限公司；乙醇（分析純）：安徽安特食品有限公司；乙酸銨（分析純）、冰乙酸（分析純）、聚酰胺粉（100目～200目）：國藥集團化學試劑公司；氨水（分析純）：西隴化工有限公司；甲酸（分析純）：上海化學試劑總廠；檸檬酸（分析純）：無錫市民豐試劑廠；試驗用水為超純水；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍標準品：百靈威試劑公司。

1.3 樣品

5種飲料樣品均購于正規超市，分別為蘋果醋飲料（1#）、橙味汽水（2#）、維生素飲料（3#）、葡萄味汽水（4#）、果粒橙飲料（5#）。

1.4 樣品處理

吸取10.0mL樣品于150mL燒杯中，碳酸飲料需經15 min超聲脫氣，有沉淀的果汁飲料應先5 000 r/min離心5 min。加入約1g聚酰胺粉，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽慮，用pH=4的水洗4次，然后用甲醇-乙酸（9∶1，體積比）混合溶液洗4次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）混合溶液解吸4次，每次約5 mL，收集解吸液至150 mL錐形瓶中，蒸發至近干，用純水定容至10mL，過0.22μm濾膜，上機測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCR BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；流速：0.30 mL/min；進樣量：5.0 μL；流動相：A 為甲醇，B 為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

為使前處理過程盡量簡便，本試驗嘗試將樣品直接過0.22 μm濾膜后即上機檢測。結果表明，1#～4#樣品可過0.22 μm濾膜，但檢測顯示目標峰附近有較多干擾，且樣品中的未知成分可能有損色譜柱和整個色譜系統，因此樣品需經處理后上機，處理過程參考國標GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》[5]，并對試驗進行了優化。

2.1.1 樣品pH值

聚酰胺粉只有在酸性條件下才可完全吸附色素。經檢測，試驗選取的飲料樣品呈弱酸性，直接加聚酰胺粉色素即可被完全吸附，若選取的飲料呈堿性，則需用檸檬酸調節pH值到6左右。

2.1.2 吸附溫度

試驗表明，樣品在室溫下和加熱至60℃聚酰胺粉吸附率無顯著差異，故樣品無需加熱。

2.1.3 雜質洗脫

參考相關文獻[7]，本試驗選用乙酸-甲醇（1 ∶9，體積比）洗脫雜質，目標物的回收率優于國標法（國標法所用的洗脫液甲醇-甲酸（6∶4，體積比）洗脫雜質，洗脫液呈藍色，檢測結果顯示有部分色素被洗脫）。

2.1.4 解析液蒸發

收集的解吸液需除去氨水和乙醇，本試驗將解吸液直接蒸發至近干即可完全除去氨水和乙醇，相較于國標先中和后蒸發的方法更為簡便，且不會影響檢測結果。

2.2 色譜分析條件選擇

2.2.1 檢測波長的選擇

由于色素的特殊結構，其不僅在紫外區有吸收，在可見光區也有最大吸收。國標及大多數文獻選用254 nm為6種色素的檢測波長，考慮到檢測靈敏度的問題，也有選擇626 nm為亮藍的檢測波長。本試驗在210 nm～700 nm進行光譜掃描，考察并比較了6種色素在可見光區的最大吸收波長和254 nm波長處的信號值響應比（見表2），結果顯示僅亮藍在兩波長處的響應值有較大差別，為避免多波長檢測時數據處理的繁瑣，初選254 nm作為檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落紅和誘惑紅的檢測波長，以626 nm為亮藍的檢測波長，但后期試驗發現亮藍在626 nm波長處的線性范圍為0.10 mg/L～10.0 mg/L，檢測上限濃度太低，只適合低濃度目標物的測定，考慮到國標GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]規定飲料類食品中亮藍所允許的最大添加量為0.02 g/kg，而亮藍在254 nm處的線性范圍為1.00 mg/L～200 mg/L，既能滿足一般樣品檢測靈敏度的要求，高濃度的樣品無需稀釋即可進行樣品處理，因此選擇254 nm為6種色素的檢測波長。

表2 6種合成色素在254 nm和最大吸收波長處的信號值響應比Table 2 Signal value response ratio of six kinds of synthetic pigment at 254 nm and maximum absorption wavelength

2.2.2 色譜分離條件

色譜柱的選擇及流動相的設置極大地影響了目標物分離效果。ACQUITY UPLC○R BEH C18色譜柱適用的pH值范圍為1～12，本試驗上機液近中性，0.02 mol/L乙酸銨流動相pH=4，此色譜柱可滿足試驗要求。試驗還考察了色譜柱長度對分離效果的影響，6種合成色素在不同長度（150、100、50 mm）色譜柱上均可較好分離，但選用50 mm色譜柱可大大縮短分析時間，且相同流量下短柱柱壓低，可減小色譜柱損耗。試驗表明，飲料樣品經前處理后，檢測時可適當提高流動相中有機相的含量，使目標峰較早出峰，因此甲醇初始比例設為13%，經多次優化梯度洗脫程序后，6種色素混標溶液的分離效果良好，分離時間僅為2.2 min（見圖1），有效地節約了分析時間，試驗將檢測時間延長至5 min，是為使柱壓穩定不影響下個樣品的進樣以及考慮到樣品中可能存在較晚出現的雜質峰。

2.2.3 檢測器

普通的紫外檢測器以色譜峰保留時間作為定性的唯一依據，此定性方法在樣品檢測中存在風險。本試驗使用的二極管陣列檢測器（PDA）可獲得色譜分離組分全波段的紫外吸收光譜圖，為分析者提供更準確的定性信息。以4#樣品為例，首先以保留時間定性，樣品檢出的色素有檸檬黃、莧菜紅和亮藍，再提取目標峰的紫外吸收光譜圖，結果顯示，樣品檢出物和標樣紫外吸收光譜圖基本一致（4#樣品和標樣紫外吸收光譜圖分別見圖2和圖3），提高了檢測結果的準確性。

圖1 檸檬黃（20.0mg/L）、莧菜紅（30.0mg/L）、胭脂紅（20.0mg/L）、日落黃（20.0mg/L）、誘惑紅（80.0mg/L）、亮藍（80.0mg/L）標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of Tartrazine（20.0 mg/L），Amaranth（30.0 mg/L），Ponceau 4R（20.0 mg/L），Sunset yellow（20.0 mg/L），Allura Red（80.0 mg/L），Brilliant Blue（80.0 mg/L）standard

圖2 4#樣品紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of 4#sample

圖3 檸檬黃、莧菜紅、亮藍標樣紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectra of Tartrazine，Amaranth，Brilliant Blue standard

2.3 線性范圍、相關系數及檢出限

在試驗條件下，對6種色素的標準系列混合溶液進行測定，以質量濃度（mg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到相應的線性回歸方程，同時以3倍信噪比考察了6種色素的檢出限，具體結果見表3。

表3 6種合成色素的線性范圍、回歸方程、相關系數和檢出限Table 3 Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of six synthetic pigments

由表3可知，6種合成色素線性范圍寬，線性關系良好，檢出限低。

2.4 樣品測定、回收率及精密度試驗

按照試驗方法分別測定1#～5#飲料中的6種合成色素含量，結果顯示1#～4#樣品均不同程度地添加了人工合成色素，實際測出的色素種類與樣品標簽一致，測定值均低于國標[1]規定允許的最大添加量。做加標回收試驗時加標量對回收率的影響較大，本試驗參考張虹的文獻報道[8]并結合試驗經驗，確定加標量如下：對于飲料中檢出的色素，加標量分別為本底值的50%、100%和200%；未檢出的色素加標量為線性范圍內低、中、高3種濃度。每個添加水平平行添加3份，計算回收率，每份測定6次，計算精密度，詳細試驗數據見表4。實際樣品的色譜圖和加標色譜圖分別見圖4和圖5。

表4 6種合成色素的加標回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of the six pigments in spiked samples（n=6）

圖4 1#樣品譜圖Fig.4 Chromatogram of 1#sample

圖5 1#樣品加標譜圖Fig.5 Chromatogram of 1#spiked sample

3 結論

本試驗方法采用超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器檢測飲料樣品中6種人工合成色素，試驗過程處理較國標法有所優化，分離效果、回收率和精密度試驗結果令人滿意，顯著降低了假陽性結果出現的概率，大大節約了分析時間（單個樣品分析時間僅需5 min），有效地減少了試劑消耗（單個樣品檢測流動相消耗為1.50 mL），綜上，本試驗方法可作為檢測飲料中上述6種人工合成色素的切實可行的檢測分析方法。

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[2] 李晶,徐濟倉,繆明明,等.固相萃取-超高效液相色譜/串聯質譜同時檢測飲料中13種禁用食品添加劑[J].分析科學學報,2013,29(4):488-492

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[5]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.35-2003.食品中合成著色劑的測定[S].北京:中國標準出版社.2004

[6]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.141-2003食品中誘惑紅的測定[S].2004

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Simultaneous Determination of Six Synthetic Pigments in Beverage with Ultra High Performance Liquid Chromatography

FANG Xiao-li
（Pingyang Center for Disease Control and Prevention，Pingyang 325400，Zhejiang，China）

An ultra-high performance liquid chromatography （UPLC）method was developed for the simultaneous determination of six kinds of synthetic pigment，including Tartrazine，Amaranth，Ponceau 4R，Sunset yellow，Allura red，Brilliant blue in beverage samples.Synthetic pigments were adsorbed by polyamide，eluted by ethanol-ammonia-water（7 ∶2 ∶1，volume ratio）after the removal of impurities，separated on an ACQUITYUPLCRBEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）in gradient elution mode using a mobile phase made up of methanol and 0.02mol/L ammonium acetate，and detected at 254 nm.The method had good effect in separating six kinds of pigment.The calibration curves had wide linearity range with correlation coefficient r≥0.999 5.The recoveries in spiked samples were in the range of 82.2%-104.5%and the relative standard deviations（RSD）were 0.04%-4.6%.

ultra high performance liquid chromatography；synthetic pigments；beverage samples

2016-12-23

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.034

方曉麗（1986—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品和生活飲用水理化檢測。