不同產地車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量測定

易滿 封傳華 湯小林 徐蘭 陶曉璇 張浪 李剛

摘要：目的 建立車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷的含量測定方法。方法 采用紫外-可見分光光度法測定車前草中總苯乙醇苷含量。HPLC測定毛蕊花糖苷含量，色譜柱為ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（13∶87），流速為1 mL/min，檢測波長為332 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 ?L。結果 不同產地車前草中總苯乙醇苷含量范圍為1.03%～3.47%；毛蕊花糖苷在0.006 2～1.55 mg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，加樣回收率為98.9%（RSD=1.6%），不同產地車前草中毛蕊花糖苷的含量范圍為0.18%～0.56%。結論 本研究建立的方法操作簡單、穩定性好、重復性較好，可用于不同產地車前草中苯乙醇苷類成分及毛蕊花糖苷的含量測定，為車前草的質量控制提供了依據。

關鍵詞：車前草；苯乙醇苷；毛蕊花糖苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）09-

Content Determination of Phenylethanoid Glycosides and Acteoside in Plantago Herba from Different Producing Areas YI Man1， FENG Chuan-hua1， TANG Xiao-lin2， XU Lan1， TAO Xiao-xuan1， ZHANG Lang1， LI Gang1 （1. No.94 Hospital of PLA， Nanchang 330002， China； 2. Children Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 330006， China）

Abstract： Objective To establish a method for determination of phenylethanoid glycoside and acteoside in Plantago Herba. Methods UV-visible spectrophotometric method was used for the determination of the content of phenylethanoid glycosides compounds in Plantago Herba. HPLC method was used for the determination of acteoside in Plantago Herba. Chromatographic column with C18 ODS2 （4.6 mm × 150 mm， 5 ?m） was used. Acetonitrile-0.1% formic acid （13：87） was as mobile phase； the flow rate was 1 mL/min； the detection wavelength was 332 nm； the column temperature was 30 ℃； the sample volume was 10 ?L. Results The contents of phenylethanoid glycoside in Plantago Herba from different producing areas were among 1.03%–3.47%. Acteoside with peak area over the 0.0062–1.55 mg range showed a good linear relationship； the sample recovery rate was 98.9%， and the RSD was 1.6%. The contents of acteoside in Plantago Herba from different producing areas was among 0.18%–0.56%. Conclusion The method is simple， stable and reproducible， which can be used for the determination of phenylethanoid glycoside and acteoside in Plantago Herba from different producing areas and provide experimental basis for quality control of Plantago Herba.

Key words： Plantago Herba； phenylethanoid glycosides； acteoside

車前草為車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，具有清熱利尿通淋、涼血、解毒等功效，主要用于熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒[1]。車前草中含有多種化學成分，如黃酮類、苯乙醇苷類、環烯醚萜類、三萜類等[2-3]。苯乙醇苷類是車前草中極具代表性的化學成分，具有抗菌、抗炎、

基金項目：2015年度軍區醫學科技創新課題項目（15MS083）

通訊作者：封傳華，E-mail：fengch1986@126.com

抗氧化等藥理活性。毛蕊花糖苷是車前草中含量較高的苯乙醇苷類成分之一，具有降低尿酸、抗高血壓、增強免疫力等作用[4-5]。不同產地車前草中苯乙醇苷類及毛蕊花糖苷的含量存在較大的差異。本研究建立紫外-可見分光光度法測定車前草中苯乙醇苷類成分含量及HPLC測定車前草中毛蕊花糖苷含量的方法，為車前草的質量評價及深度開發提供依據。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（包括CTO柱溫箱、SIL-10AF自動進樣器、LC-15C泵、SPD-15C紫外檢測器），UV-765紫外可見分光光度計（上海軍科），AUW120D型分析天平（島津公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械廠），KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DFT-50手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

毛蕊花糖苷（成都普菲德生物技術有限公司，批號150401，純度>98%）；不同產地車前草，均購自江西樟樹中藥材市場，經江西中醫藥大學禇小蘭教授鑒定為車前Plantago asiatica L.的干燥全草；乙腈（色譜純，天津市大茂化學試劑廠，批號201510011）；甲酸（分析純，西隴化工股份有限公司，1012051）；甲醇（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司，20130320）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總苯乙醇苷含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為0.31 mg/mL的毛蕊花糖苷對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取車前草粉末（過2號篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

2.1.3 檢測波長的選擇 取毛蕊花糖苷對照品溶液及供試品溶液，于190～800 nm波長范圍內測定各溶液的紫外吸收，結果顯示兩者的紫外吸收圖譜相似，且在波長為332 nm處均有最大吸收，故選擇332 nm作為車前草中總苯乙醇苷含量測定的波長。

2.1.4 標準曲線繪制 精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，同時以相應的溶劑作空白，于332 nm波長處測定各對照品溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=41.982X-0.221 3，r=0.999 5（n=3）。結果表明，毛蕊花糖苷質量濃度在0.003 1～0.155 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.5 樣品含量測定 取車前草樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定。每份樣品平行測定3次，計算總苯乙醇苷含量。

2.2 毛蕊花糖苷含量測定

2.2.1 色譜條件 采用迪馬ODS2 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.1%甲酸（15∶85），流速1 mL/min，檢測波長332 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 ?L。理論板數按毛蕊花糖苷計算應不低于3000。色譜圖見圖1。

A

B

注：A.對照品；B.供試品（江西高安）；1.毛蕊花糖苷

圖1 車前草中毛蕊花糖苷HPLC圖

2.2.2 標準曲線繪制 分別精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液0.02、0.05、0.2、0.5、1、2、5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 ?L注入高效液相色譜儀，測定。以質量濃度對峰面積繪制標準曲線，得回歸方程Y=1 000 000X-5832.2，r=0.999 1。結果表明，毛蕊花糖苷在0.006 2～1.55 mg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 取同一對照品溶液，連續進樣6次，進樣量均為10 ?L，按上述色譜條件進行測定，結果毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.76%，表明精密度良好，符合含量測定的基本要求。

2.2.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，結果毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.89%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.2.5 重復性試驗 取同一批樣品粉末（過2號篩），按供試品溶液制備方法平行制備6份溶液，分別精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，計算毛蕊花糖苷峰面積RSD=1.52%，結果表明，本方法重復性較好。

2.2.6 加樣回收率試驗 取同一批已知毛蕊花糖苷含量的樣品粉末（過2號篩），精密稱取6份，分別加入毛蕊花糖苷對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備，分別精密吸取10 ?L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.2.7 樣品含量測定 取車前草樣品，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，取續濾液進樣，根據已建立的色譜條件測定毛蕊花糖苷的峰面積，代入線性回歸方程，計算車前草中毛蕊花糖苷含量。

2.3 樣品測定結果

取12個不同產地的車前草，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法和色譜條件分別測定總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量，結果見表2。

3 討論

在建立苯乙醇苷類含量測定方法過程中，本研究考察了溶劑種類、乙醇濃度、pH值、提取時間、提取次數、溶劑體積多個因素對提取效果的影響[6-8]，并選取影響提取效果較大的4個因素（乙醇濃度、pH值、提取時間和提取溶劑體積）進行正交試驗，確定了車前草中苯乙醇苷類的提取方法，同時進行了多批次驗證試驗，結果表明該方法比較穩定，可用于車前草中苯乙醇苷類的提取。

毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在多個波長下均有吸收，通過比較，最終選擇332 nm為檢測波長，在此波長下，雜峰對這2種成分含量測定的干擾最小[9-10]。同時，在考察毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取方法過程中，比較了甲醇、乙醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇6種不同的提取溶劑，對比了回流提取、超聲提取和靜置提取3種不同的提取方法，考察了不同提取時間和提取次數對兩者含量測定的影響，最終確定采用50%乙醇回流提取2次、每次2 h的提取方法。

本研究共收集了12個不同產地的車前草樣品，研究結果顯示，不同產地車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷的含量存在較大差異，可能與產地的地理環境、氣候、田間管理、采收加工等有較大的相關性。中藥材內在成分含量不同，對臨床藥效存在較大的影響，為獲得質量穩定、成分明確、藥效可靠的藥材，應盡量選擇符合GAP的車前草。

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（收稿日期：2017-01-09）

（修回日期：2017-02-13；編輯：陳靜）