GeneXpert MTB/RIF技術對成年人結核性腦膜炎診斷價值的研究

楊元利 張永峰 劉元 周九鵬 竇權利 黨麗云

·論著·

GeneXpert MTB/RIF技術對成年人結核性腦膜炎診斷價值的研究

楊元利 張永峰 劉元 周九鵬 竇權利 黨麗云

目的 評價GeneXpert MTB/RIF技術檢測腦脊液中的結核分枝桿菌對成年人結核性腦膜炎(TBM)的早期診斷價值。方法 選取西安市胸科醫院2015年6月至2016年12月期間診治的疑似結核性腦膜炎成年患者90例作為研究對象。研究對象均經抗結核藥物治療時間<2周，年齡≥18歲。收集患者腦脊液樣本，分別用抗酸染色法、液體培養法、GeneXpert MTB/RIF技術檢測。按照最新的結核性腦膜炎診斷標準，以臨床評分≥6分作為參考標準，對研究對象進行分組，評價GeneXpert MTB/RIF技術的診斷價值。結果 90例研究對象中參照臨床評分標準，確定為TBM組61例，非TBM組29例。GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本陽性25例，敏感度為41.0%(25/61)，特異度為100.0%(29/29)，陽性預測值為100.0%(25/25)，陰性預測值為44.6%(29/65)。GeneXpert MTB/RIF檢測未離心腦脊液標本、液體培養法、抗酸染色法檢測TBM的敏感度分別為23.0%(14/61)、18.0%(11/61)、4.9%(3/61)。GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本的敏感度高于檢測未離心腦脊液標本、液體培養法及抗酸染色法，差異均有統計學意義(χ2=4.56，P=0.033；χ2=7.72，P=0.005；χ2=22.43，P<0.05)。25例經GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本陽性患者中檢出利福平耐藥1例，與傳統藥敏結果一致。結論 GeneXpert MTB/RIF技術能快速特異地檢測腦脊液中結核分枝桿菌，與抗酸染色和液體培養比較具有較高敏感度，其檢測的腦脊液標本經離心濃縮處理后可提高其診斷敏感度。

結核，腦膜； 核酸擴增技術； 早期診斷； 利福平； 抗藥性

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的中樞神經系統感染性疾病，約占結核病發病的5%～10%,具有較高的病死率和致殘率[1-2]。因此，早期快速準確的診斷對于TBM治療及預后具有重要的意義。腦脊液的MTB涂片和培養陽性率偏低，在TBM診斷中價值不大。2011年，WHO推薦將GeneXpert MTB/RIF技術作為肺結核或疑似耐藥肺結核及并發HIV感染結核病患者的首選篩查方法[3]。筆者即應用GeneXpert MTB/RIF技術檢測成年TBM患者腦脊液標本，以探討其對成年人TBM的診斷價值。

對象和方法

1.研究對象：選取西安市胸科醫院2015年6月至2016年12月期間診治的疑似TBM成年患者90例作為研究對象。研究對象均經抗結核藥物治療時間<2周，年齡≥18歲。參照2010年國際TBM協作組制定的診斷標準[4]，評分標準見表1。具備以下一項或多項腦膜炎的癥狀和體征：頭痛、易激惹、嘔吐、發熱、頸項強直、抽搐、局灶性神經功能缺損、意識障礙或倦怠；根據患者的臨床表現，腦脊液和頭顱影像學檢查結果，以及其他部位結核確診證據進行評分，最終將患者分為4組：(1)確診組：符合臨床診斷標準，同時腦脊液檢出抗酸桿菌，或腦脊液MTB或抗酸檢測陽性；(2)很可能組：符合臨床診斷標準，同時臨床評分≥10分(無神經影像學表現)或臨床評分≥12分(伴神經影像學表現)，并排除其他類型腦膜炎；(3)可能診斷組：符合臨床診斷標準，同時臨床評分為6～9分(無神經影像學表現)或臨床評分為9～11分(伴有神經影像學表現)，而未行腰椎穿刺腦脊液檢查或神經影像學檢查者不得確診；(4)非TBM組：不符合臨床標準，未進行抗結核藥物治療，排除TBM。將前3組(即臨床評分≥6分)作為TBM組，與非TBM組比較，進行后續試驗結果的分析。本研究方案獲得本院醫學倫理委員會的批準。

表1 結核性腦膜炎的臨床診斷評分

注 排除診斷：根據患者年齡、免疫狀況、所在地理區域等情況綜合判斷。需排除以下診斷：化膿性腦膜炎、新型隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、腦型瘧疾、嗜酸性粒細胞性腦膜炎、腦弓形體病、腦膿腫、腦惡性腫瘤。排除這些診斷需要確鑿的微生物學或病理學證據

2.儀器與試劑：(1)儀器：BACTEC MGIT 960液體培養系統(美國BD公司，批號：4087168)；Gene Xpert MTB/RIF擴增檢測儀(美國Cepheid公司，批號：4140541)。(2)試劑：抗酸染色試劑(珠海貝索生物有限公司)；MGIT液體培養管(美國BD公司)、分枝桿菌聯合藥物敏感性檢測試劑盒(美國BD公司)；分枝桿菌培養添加試劑盒(美國BD公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測試劑盒(美國Cepheid公司)。

3.抗酸染色法：抗酸染色涂片檢查參照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[5]中的標準化操作程序執行。具體方法為標本涂片，干燥后行抗酸染色、鏡檢。

4. BACTEC MGIT 960培養和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)：采用BACTEC MGIT 960液體培養，參照《結核分枝桿菌藥物敏感性實驗標準化操作程序及質量保證手冊》[6]中的標準化操作程序執行。取處理好的腦脊液標本1 ml加入MGIT液體培養管中，放入BACTEC MGIT 960液體培養系統中進行培養；培養陽性的標本進一步行藥敏試驗。BACTEC MGIT 960系統藥敏試驗是將從結核病患者分離得到的MTB在已知濃度的檢測藥物存在的條件下進行體外培養，觀察其生長狀況，同時與不加任何藥物的對照管進行比較，若菌株在對照及藥物培養管中均生長，則認為該菌株對該藥物耐藥；若只在對照管中生長，則認為該菌株對該藥物敏感。

5.腦脊液GeneXpert MTB/RIF檢測：(1)收集每例患者腦脊液6 ml，1 ml直接與2倍體積的處理液混勻，渦旋振蕩1 min，取2 ml混合液放入儀器中進行核酸擴增。2 h內儀器會自動輸出檢測結果，即菌量及是否對利福平耐藥。當6條探針中除了質控探針外至少2條探針發出熒光時可判定為MTB感染。(2)另5 ml腦脊液經3000×g離心15 min，去上清，留1 ml與2倍體積的處理液混勻，渦旋振蕩1 min，取2 ml混合液放入儀器中進行核酸擴增，2 h內儀器會自動輸出檢測結果，即菌量及是否對利福平耐藥。當6條探針中除了質控探針外至少2條探針發出熒光時可判定為MTB感染。

6.統計學分析：應用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.基本情況：90例研究對象中，經液體培養陽性，確診為TBM者11例(12.2%，11/90)。50例雖然無明確病原學依據，但符合很可能組(36例)和可能診斷組(14例)的臨床評分要求。另外29例(32.2%，29/90)為非TBM者，包括病毒性腦膜炎17例、化膿性腦膜炎5例、新型隱球菌性腦膜炎4例、腦肺包蟲病1例、系統性紅斑狼瘡腦病1例、腦布氏桿菌病1例。

2.檢測效能比較：GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本陽性25例，敏感度為41.0%(25/61)，特異度為100.0%(29/29)，陽性預測值為100.00%(25/25)，陰性預測值為44.6%(29/65)。GeneXpert MTB/RIF檢測未離心腦脊液標本、液體培養法、抗酸染色法檢測TBM的敏感度分別為23.0%(14/61)、18.0%(11/61)、4.9%(3/61)。GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本的敏感度高于檢測未離心腦脊液標本、液體培養法及抗酸染色法，差異均有統計學意義(χ2=4.56，P=0.033；χ2=7.72，P=0.005；χ2=22.43，P<0.05)，見表2。

3.利福平耐藥檢測：25例經GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本陽性患者中檢出利福平耐藥1例。該例是經培養確診的TBM，使用MGIT SIRE試劑盒進行檢測，得出此株MTB的藥敏結果為異煙肼、利福平均耐藥；其余24例患者經GeneXpert MTB/RIF檢測結果均為利福平敏感，其中10例液體培養陽性，菌株經檢測也均為利福平敏感。

討 論

TBM是結核病最嚴重的形式，預后依賴于早期快速診斷，所以尋找早期快速準確的診斷方法一直是臨床上亟待解決的問題。最新的TBM診斷專家共識指出，腦脊液培養、抗酸染色或PCR中任意一項陽性者可確診為TBM[4]；但腦脊液抗酸染色、MTB培養陽性率低，且培養花費時間久，約4～6周，對TBM早期診斷價值有限[7]。

GeneXpert MTB/RIF技術以熒光定量PCR技術為基礎，集樣品收集、核酸提取、樣品擴增于一體，其對目標DNA序列的檢測具有高度光學敏感度，實時光學監測一經發現目標序列即可給出報告，極大縮短了化驗檢測時間，從上樣到結束的全過程約2 h，且操作方便。目前，GeneXpert MTB/RIF法因其較高的敏感度和特異度已逐漸開展并廣泛應用于肺結核及肺外結核的診斷[8-10]。WHO推薦GeneXpert MTB/RIF檢測為TBM初次檢測優先方案，該方法在TBM的早期診斷中有巨大優勢[11-12]。Nhu等[11]研究顯示以臨床診斷為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感度為59.3%，特異度為99.5%，通過在樣本前處理中加入渦旋混勻步驟，其敏感度提高了20.6%，檢測并發HIV感染的TBM患者敏感度高達78.8%。

表2 不同方法檢測結核性腦膜炎患者腦脊液標本的檢測效能

注 敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

本次研究共納入90例疑似TBM成年患者的腦脊液標本，由于TBM患者的腦脊液微生物學檢測陽性率低，確診患者較少，故此次研究將臨床診斷作為金標準。結果顯示，GeneXpert MTB/RIF檢測離心腦脊液標本的敏感度高于傳統抗酸染色法、液體培養法，以及未離心標本的檢測，差異均具有統計學意義，這一結果在TBM臨床診斷中具有非常重要的意義。其與國外研究比較，本次研究敏感度不高的原因考慮可能為納入患者數量少；另一方面，國外研究中TBM并發艾滋病患者所占比例多，這類患者免疫力較差，腦脊液中MTB含量可能較多，這可能會增加GeneXpert MTB/RIF的檢出效率[11-12]。從檢測特異度方面來看，GeneXpert MTB/RIF具有非常好的確定診斷的價值，本研究中為100.0%，并通過臨床癥狀、影像學、腦脊液化驗及治療隨訪證實符合TBM。

GeneXpert MTB/RIF技術可以同時檢測利福平耐藥，該技術以MTB的rpoB基因為靶基因，自動提取DNA后擴增rpoB基因進行檢測。本次研究中應用GeneXpert MTB/RIF檢測出1例利福平耐藥，并通過傳統藥敏試驗得以確認。由于本次研究耐藥TBM例數少，尚不能評價其耐利福平的檢測效能。

綜上所述，GeneXpert MTB/RIF技術有其顯著的優點：第一，能快速特異地檢測腦脊液中MTB，全部檢測過程2 h，與抗酸染色和液體培養法比較具有較高敏感度，并且該技術對于優化即離心濃縮處理后的腦脊液標本具有更高的檢測敏感度；第二，可用于檢測MTB的利福平耐藥性，為臨床提供可靠的依據；第三，檢測系統操作簡單，將復雜步驟集中完成，避免人工提取過程中可能污染造成的假陽性結果；第四，本研究對照組中無一例檢測為陽性，特異度為100.0%。結合以上優點，GeneXpert MTB/RIF技術可以作為成年人TBM早期診斷的分子檢測手段。

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(本文編輯：李敬文)

Diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF for tuberculous meningitis in adults

YANGYuan-li,ZHANGYong-feng,LIUYuan,ZHOUJiu-peng,DOUQuan-li,DANGLi-yun.

Xi’anChestHospital,Xi’an710100,China

Correspondingauthor:DANGLi-yun,Email:dangliyun@sina.com

Objective To evaluate the diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF for the early diagnosis of tuberculous meningitis in Adults. Methods Ninety predominantly adults with suspected meningitis were screened prospectively from Xi’an chest hospital between June 2015 and December 2016. All subjects aged ≥18 years were treated with anti-tuberculosis drug for <2 weeks. Samples of cerebrospinal fluid were collected and tested by Ziehl-Neelsen staining, MGIT960 liquid culture and GeneXpert MTB/RIF. And the enrolled patients were grouped according to 2010 South African expert consensus. The diagnostic performance of GeneXpert MTB/RIF was evaluated by camparing against clinical scored ≥6 points. Results Of the 90 patients,61 were in TBM group, and 29 were in no-TBM group. Twenty-five positive cases of cerebrospinal fluid (CSF) were tested by GeneXpert MTB/RIF,the sensitivity was 41.0% (25/61),the specificity was 100.0% (29/29),the positive predictive value was 100.0% (25/25),and the negative predictive was 44.6% (29/65).The sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (non-centrifugal CSF), MGIT 960 liquid culture and Ziehl-Neelsen staining were 23.0% (14/61), 18.0% (11/61) and 4.9% (3/61), respectively. Compared with the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (centrifugal CSF),the significant differencse were found among the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF (non-centrifugal CSF),MGIT 960 liquid culture and Ziehl-Neelsen staining (χ2=4.56,P=0.033;χ2=7.72,P=0.005;χ2=22.43,P<0.05). Rifampin resistance was found in 1 case, consistent with traditional drug susceptibility test. Conclusion GeneXpert MTB/RIF is a rapid and specific method to detect MTB in CSF. Compared with Z-N stain and MGIT 960, it has higher sensitivity. After centrifugal CSF, it could improve the sensitivity of diagnosis of TBM.

Tuberculous, meningeal; Nucleic acid amplification techniques; Early diagnosis; Rifampin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.09.016

西安市衛生和計劃生育委員會科研項目(J201602017)

710100 西安市胸科醫院

黨麗云，Email：dangliyun@sina.com

2017-03-15)